В марте 2025 года в журнале International Journal of Biological Macromolecules была опубликована статья « Attenuation of cardiac ischemia / reperfusion injury via the decoy receptor DcR2 by targeting the PLAD domain of the death receptor DR5».

Целью этого исследования было определить целевую точку действия DcR2 и изучить механизм защиты сердечной мышцы DcR2 при повреждении I / R сердечной мышцы у мышей. Результаты показали, что слияние белков hDcR2 - Fc оказывает значительное защитное воздействие на ишемические / повторные повреждения сердечной мышцы. DcR2 образует гетерогенный комплекс с DR5 через свой домен структуры PLAD, который не имеет полного домена структуры смерти и поэтому не может передавать сигналы вниз по течению. Кроме того, образование комплекса маскирует точки взаимодействия с рецептором TRAIL, тем самым уменьшая гибель клеток сердечной мышцы после ишемической / повторной инъекционной травмы. Таким образом, это исследование показывает, что домен PLAD DcR2 играет ключевую роль в подавлении клеточного апоптоза, предлагая потенциальные цели для разработки новых лекарств.

Лицжи Чжан, Синьюань Чжан, Цзинь Ли, Тингтинг Мо, Хотя Фэн, ЦзиньЛунь Чжан, Дань Чжао, Инь Ван, Иньцзян Вэй, Яохуи Ван

Совместная национальная лаборатория по разработке антител, первая аффилированная больница, университет Хэнань, Кайфэнь, Китай

Медицинская школа, университет Хэнань, Кайфэнь, Китай

Объединенная национальная лаборатория по разработке антител, университет Хэнань, Кайфэнь, Китай

Чжоу, Д. и др.

Термическая стабильность белка - это способность к деформации полипептидной цепи белка под воздействием температуры, которая в основном отражается в химических свойствах полипептидной цепи при изменении температуры и изменении пространственной конфигурации, чем меньше изменение, тем выше тепловая стабильность. На термическую стабильность белков влияют различные температуры, pH, ионная прочность и другие внешние факторы, в биотехнологии, фармацевтических исследованиях и разработках, пищевой промышленности и других областях, имеет большое значение.

Температура дегенерации белка является важной концепцией для биологов, изучающих термическую стабильность белка, которая относится к температурным точкам, при которых структура белка изменяется, когда он подвергается тепловому воздействию в определенных температурных условиях, и когда температура выше, белок превращается из стабильной трехмерной структуры в свободную неупорядоченную структуру. Термическая стабильность белка обычно выражается с использованием температуры медианы термодегенерации (Tm), то есть температуры, при которой белки распадаются на 50%.

01 Предисловие

Смерть клеток сердечной мышцы, вызванная ишемической гипоксией, является основной причиной повреждения сердечной мышцы. DcR2 является заманивающим рецептором TRAIL, и роль DcR2 в повреждении ишемии миокарда / повторной инъекции (I / R) неясна. Недавние исследования показали, что DcR2 не только связывается с TRAIL как рецептор, но и блокирует вызываемую TRAIL цитопатию in vitro в качестве рецептора DR5, но предпочтения DcR2 к TRAIL или DR5 в организме неясны. Предыдущие исследования показали, что слияние белков hDcR2 - Fc играет защитную роль в сердце в модели повреждения I / R сердечной мышцы мышей, достигая снижения клеточного апоптоза. Тестирование на сродство показало, что DcR2 более близок к DR5, чем к TRAIL, и что DcR2, как правило, связывается с DR5. Исследования механизмов показывают, что отсутствие PLAD устраняет защитный эффект hDcR2 - Fc от повреждения сердечной мышцы, вызванного I / R. DcR2 образует гетерогенный комплекс с DR5 через аналогичный домен структуры PLAD. Подводя итог, это исследование показывает, что DcR2 может формировать гетерогенные комплексы, направленные на DR5 через домен структуры PLAD, блокируя цитопатию, тем самым улучшая повреждение сердечной мышцы I / R и предлагая новую стратегию профилактики для лечения повреждений сердечной мышцы I / R.

02 Резюме

Острый инфаркт миокарда (AMI) является серьезной угрозой для жизни и здоровья человека, и смертность от AMI остается высокой во всем мире. Смерть клеток сердечной мышцы, вызванная ишемической гипоксией, является необратимым повреждением. Интервенционная терапия кожной коронарной артерии (PCI) может эффективно снизить смертность у пациентов с острым инфарктом миокарда, но есть две основные проблемы: короткое золотое время лечения и ишемическая / повторная инъекция (I / R) травмы. Кроме того, высока частота длительной сердечной недостаточности. Чтобы сузить диапазон инфаркта миокарда, продлить « оконный» период смерти клеток миокарда и улучшить долгосрочный прогноз пациента, необходимо разработать новые методы лечения, которые могут уменьшить или обратить вспять повреждение сердца.

Инфаркт миокарда обычно сопровождается рядом патологических изменений, наиболее серьезным из которых является апоптоз клеток миокарда. Однако в клинической практике нет эффективной стратегии лечения апоптоза клеток сердечной мышцы. Поэтому поиск ключевых целей для предотвращения апоптоза миокарда может предложить новые стратегии для профилактики и лечения инфаркта миокарда. Коэффициент некроза опухоли (TNF), связанный с индуцированным апоптозом рецептором (TRAIL), также известный как рецептор Apo2, относится к суперсемейству рецепторов TNF. На сегодняшний день люди идентифицировали пять рецепторов TRAIL. DR4 (TRAIL - R1) и DR5 (TRAIL - R2), известные как рецепторы смерти (DRS), имеют полный домен структуры смерти (DD), способный передавать сигналы смерти, регулируемые TRAIL. DRS опосредует активацию соответствующих нисходящих сигнальных путей, что приводит к отмиранию клеток, где DR5 является основным рецептором смерти.авторПредыдущие исследования подтвердили, что слияние белков sDR5 - Fc может специфически блокировать путь TRAIL - DR5, улучшая функцию сердца после инфаркта миокарда у обезьян, свиней и крыс.

03 Результаты

Чтобы определить, является ли PLAD посредником между DcR2 и DR5,авторБыли подготовлены слияния DcR2 дельта PLAD - Fc, отсутствующие в домене структуры PLAD. Удаление домена структуры PLAD не повлияло на вторичную структуру DcR2, но температура плавления (Tm) несколько снизилась, что указывает на снижение стабильности. Последующее определение близости DcR2APLAD - Fc к TRAIL составило 4.724×10 - 7M, что несколько ниже, чем у дикого типа. Результаты экспериментов по блокированию цитопатии показали, что DcR2 не может блокировать цитопатию после удаления домена структуры PLAD, что подтверждает важность домена структуры PLAD.

Авторы далее использовали анализатор стабильности белка PSA - 16 для анализа тепловой устойчивости NiV G - ferritin и NiV sG по принципу дифференциальной сканирующей флуоресценции (Differential scanning fluorimetry, DSF), и результаты показали, что NiV G - ferritin и NiV sG продемонстрировали аналогичную тепловую стабильность с Tm ~ 65°C, что указывает на то, что слияние NiV G и Ferritin не оказало существенного влияния на их структурную стабильность.

Поскольку NiV G - ferritin может вызывать * гуморальный иммунный ответ, исследователи также отобрали и подготовили партию моноклональных антител (monoclonal antibody, mAb) у мышей с иммунитетом NiV G - ferritin. Из 27 отдельных видов мAbs 25 мAbs могут эффективно подавлять инфекцию вируса волдыревого стоматита (VSV) в скелете псевдовируса NiV с концентрацией, необходимой для подавления 50% псевдовирусной инфекции NiV (IC50) ниже 10 нг / мл. Анализ поверхностной конкуренции показал, что отобранные 27 мAbs могут идентифицировать четыре различных антигенных позиции на белке NiV G, в том числе два новых ранее не сообщалось. Наконец, исследователи оценили иммунный ответ и защитные эффекты, вызванные NiV G - ferritin, на смертельной модели инфекции Ниппавирусом (сирийский золотой хомяк). Исследование показало, что после введения 2 или 3 игл NiV G - ferritin у хомяков вырабатывалась высокоуровневая и активная сыворотка крови, и две или три прививки помогли хомякам на 100% противостоять атаке смертельной дозы NiV. Исследователи дополнительно проверили содержание вирусной РНК в трех вакцинированных хомяках и обнаружили, что вирусная РНК не была обнаружена в легких, мозге и селезенке хомяка, что указывает на то, что три дозы NiV G - ferritin подавляли репликацию вируса в легких, мозге и селезенке хомяка.

04 Способы

дифференциальный метод флуоресценции

Термическая стабильность белка - мишени измеряется с помощью прибора PSA - 16 (Beijing Baister Technology Co. Ltd.) с помощью дифференциальной сканирующей флуоресценции (Differential scanning fluorimetry, DSF). Образец разбавляется до 0,5 мг / мл, а образец, разбавленный до 20 мкл, помещается в кварцевую стеклянную трубку. Используя линейное температурное сканирование от 23 до 97 °C, динамическое измерение флуоресцентной интенсивности (F) белка - мишени 330 нм и 350 нм при ультрафиолетовом возбуждении 280 нм в реальном времени со скоростью нагрева 1 °С / мин. Средняя температура термодегенерации рассчитывается на основе наклона кривой F350 нм / F330 нм (Thermal transition midpoint, Tm). Каждый образец измеряется четыре раза параллельно.

Многоугольная оптическая связь с диаметром частиц исключает хроматографическое рассеяние (SEC - MALS)

Каждый образец объемом 100 мкл (NiV g - ферритин 0,5 мг / мл, 2 мг / мл) mL (NiV sG) вводит хроматографическую колонку WTC - 030S5 (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA), изотермическая работа 0,5 мЛ / мин с 20 мМТris - HClpH8.0 и 150 ммнаcl в качестве фазы движущегося конца. Детектор MALS (DAWN) ®) И детектор преломления (RI) (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA) последовательно подключается к ультрафиолетовому детектору в системе SEC. Белок сыворотки крупного рогатого скота (BSA использует Scientific) для нормализации статических детекторов рассеяния света. Рассеяние света, дифференциальная скорость преломления (dRI) измеряется, и молекулы используют программное обеспечение ASTRA (6.1.2.84) (Wyatt Technology).

Иммунодесорбционный тест ферментативной связи (ELISA)

Метод ELISA используется для обнаружения антигенности белка NiV g - железа. Проще говоря, 96 - с 3 мкг / мл NiV при 4 ° C упакован пластиной ELISA (Corning) на ночь SG или NiV g - железобетонным покрытием буфера (0.1 Mcarbonate, pH9.6). Последние четыре промываются PBS - T (pbs содержит 0,05% Tween 20) 1 раз, все отверстия блокируются 50 мкл блокирующим буфером (1% BSA в PBS - T) при 37°C 2 ч. После блокировки, NiV G моно - анти HENV - 32, HENV - 26, nAH1.3, антибешенство моно - анти - RVC20 (отрицательный контраст) разбавляется последовательно с 5 мкг / мл в пластину, 37 инкубаторов 2 ч PBS - T°C 4 раза, а затем добавляется к HRP - связывающему человеку с антитело (IG: 1). 20 000 разбавленный, ab клон, AS002) Сохранить 1 ч при 37°C. Посуда промывается красящим раствором (NCMbiotech) при 37°C в течение 10 - 30 минут с помощью однокомпонентного TMB - красителя с 50 мкл / отверстий. Реакция субстрата добавляет 50 мкл / отверстие 1М HCl с поглощением света на 450 нм (OD450). Для анализа сыворотки, связанной с титрами,Автор принялБелки G - головки NiV - M, NiV - B, NiV - B помещают пакеты HeV, LayV и MojV на пластину ELISA, а HRP соединяется козьей антимышей IgG (1: 8000 разбавлен, ab клонирован, AS003)。

...............................................................................................................................................................................................................................................................

05 Резюме

Подводя итог, в исследовании была успешно разработана новая вакцина - кандидат на наночастицы с антигенной мишенью на поле головы белка NiV G, платформой для демонстрации ферритина и выделена группа моноклональных антител с потенциальным терапевтическим эффектом. Исследования дают новое понимание иммуногенности G - белка вируса Ниппа, и ожидается, что NiV G - ferritin продолжит разработку широкого спектра кандидатных вакцин против вируса Хенипа, предлагая новые стратегии защиты для глобальной безопасности общественного здравоохранения.

Исследователь Чжао Хайян из Национальной ключевой лаборатории вирусологии Уханьского университета и исследователь Дэн Цзэнцинь из Уханьского института вирусологии Китайской академии наук являются соавторами статьи. Чжоу Дань, аспирант Школы наук о жизни Уханьского университета, Чэн Шу, выпускник магистратуры, и д - р Яо Яньфэн, старший экспериментатор Уханьского института вирусологии Китайской академии наук, являются соавторами диссертации.

Исследование финансировалось Национальным проектом ключевых исследований и разработок, проектом молодых талантов Комитета здравоохранения провинции Хубэй и проектом талантов Академии наук Китая, а также при поддержке Национальной лаборатории биобезопасности в Ухане и Национальной ключевой лаборатории вирусологии в Ухане.

Оригинальная ссылка: https://www.nature.com/articles/s41541-024-00954-5

С помощью анализатора стабильности белка PSA - 16, самостоятельно разработанного Beijing Baister Technology Co., Ltd. автор провел анализ тепловой устойчивости NiV G - ferritin и NiV sG по принципу дифференциальной сканирующей флуоресценции (Differential scanning fluorimetry, DSF). Результаты показывают, что NiV G - ferritin и NiV sG демонстрируют аналогичную тепловую стабильность, Tm ~ 65 °C, что указывает на то, что слияние NiV G и Ferritin не оказывает существенного влияния на их структурную стабильность.