Органоидный обмен веществанализприбор: микрофизиологическая системамониторингТрансуэллТрехмерная модель тонкой кишки.

Ткань-на-чип:Микрофизиометрия СЧеловеческие 3D-моделиТрансуэллВставки

Микрофизиологические измеренияДоказано, что он является полезным инструментом для мониторинга энергетического обмена живых клеток и межклеточных взаимодействий, которые ранее в основном использовались для мониторинга двумерного клеточного слоя. Недавно наша команда обнаружила, что микрофизиологические измерения также могут автоматически определять скорость экстраклеточного подкисления 3D - культур кожи ивеличина трансэпителиального сопротивления(TEER)， Культивы культивируются в закрытых биочипах, напечатанных на 3D - принтере для поддержания газожидкостного интерфейса (ALI). В этой работе мы предложили оптимизированный многоканальный чип для мониторинга коммерциализированной 3D - модели ткани тонкой кишки TEER. Эксперимент длится 1 день, 60 минут - повторяющийся цикл, каждый из которых состоит из трех этапов: (1) поддержание газожидкостного интерфейса (ALI); (2) Добавить измеренияСредаИли испытания; (3) Чистка. После первоначального равновесия в течение 8 часов, добавление цитотоксичных и барьерно - разрушающих химических веществ (0,2% додекаалкилов *) привело к постепенному снижению TEER с течением времени, в то время как предыдущие традиционные методы измерения клеточной токсичности не могли отслеживать это изменение. Эта работа подтвердила многоканальное использование автоматического газожидкостного интерфейса (ALI) в реальном временимониторингВозможность трехмерной модели кишечника TEER. Культивированные человеческие ткани в сочетании с интеллектуальными мобильными методами обнаружения обеспечивают очень перспективный исследовательский инструмент для диагностики in vitro, особенно в области токсикологии, исследований клеточного метаболизма, абсорбции лекарств и других исследований.

Ключевые слова:микрофизиометрия, трансэпителиальное электрическое сопротивление, мониторинг без маркировки, кишечная модель, автоматизированный воздушно-жидкий интерфейс

ВВОДЕНИЕ

Несмотря на полные испытания, проведенные на доклиническом этапе разработки препарата, неизвестная токсичность по - прежнему является распространенной причиной неудач на клиническом этапе (Kola and Landis, 2004; Marx et al. 2016). В исследовании токсичности препарата важно учитыватьТонкая кишкаЭффект поглощения. Доклиническая оценка организма обычно основана на мышиной или крысиной модели.Характеристика человека (LeФеррецet al.， 2001 год). Однако модели грызунов не могут надежно предсказать воздействие препарата на все аспекты человеческого организма, поэтому может возникнуть неправильная оценка токсичности или повторного всасывания препарата. Таким образом, в последние годы акцент в исследованиях сместился на улучшение исследований экстракорпоральной токсичности.

Изучение повторяемости и способности отделять переменные воздействия in vitro (Ferrick et al. 2008) помогает улучшить географические механизмы детоксикации. Но 2D - клеточная культура и клеточная линия (Leonard et al. 2010;Айехуниet al., 2018) Ограниченная физиологическая корреляция и отсутствие полностью автоматического анализа в экспериментах по выращиванию клеток были описаны в предыдущей литературеБО (Гомес - Джей? berg et al., 2007;Мейвантссонet al., 2008; Li et al.,2013）。 Последние достижения в области 3D - клеточной культуры устраняют эти ограничения и предлагают новые модели для повышения уверенности в безопасности и эффективности новых лекарств.Эглен, 2017; Park et al., 2018 год). Использование метода « тканевого чипа» для улучшения оценки абсорбции, распределения, метаболизма и выведения (ADME) с помощью моделей тканей и органов, культивируемых in vitro (Madden et al. 2018).

Однослойные клетки Caco - 2, извлеченные из рака толстой кишки (толстой кишки), представляют собой клеточную линию, широко используемую для экстракорпоральной абсорбции лекарств и оценки токсичности, которая может представлять три пути абсорбции: межклеточный (внутриклеточный), межклеточный (внеклеточный) и транспортер - носитель. Однако релевантность клеточной линии и ткани тонкого кишечника ограничена. В литературе (Shah et al., 2006) уже описано, что он может только предсказывать проникновение через межклеточные (внутриклеточные пути). Кроме того, культивируемые стенками однослойные капо - 2 - пептидные клетки не имеют взаимодействия клеток - клеток и внеклеточной матрицы и не могут имитировать многослойную сложную структуру тонкой кишки человека. Чтобы преодолеть этот недостаток физиологической корреляции, ученые разработали новую трехмерную модель реконструированной ткани человека.(Li et al., 2013 год;Айехунии др., 2018). Выращивание трехмерной модели органов тонкой кишки на воздушно - жидком интерфейсе (ALI) компенсирует морфологический дефект 2D в культуре in vitro (Носсоли др., 2011 год).

Общие методы анализа воздействия наркотиков с использованием экстракорпоральной культуры тканей требуют множества повторяющихся образцов тканей и громоздких и сложных экспериментальных шагов. Сложность методов и измерений приводит к необходимости большого количества искусственных и связанных с клетками или тканями аппаратных средств, которые, в свою очередь, могут привести к повреждению клеток и увеличить просчет результатов (Blume et al. 2010).

По сравнению с ручным тестированием, автоматический анализ выживаемости клеток в реальном времени является более оптимальной схемой измерения абсорбции и токсичности. Кроме того,Данные мониторинга в режиме реального времени позволяют проводить краткосрочный и долгосрочный анализ. Для долгосрочного мониторинга автоматизация заменяет искусственную замену среды и добавление реагентов для увеличения потока и повторения экспериментов (Kempner and Felder, 2002). Короче говоря, непрерывные измерения клеточной культуры в реальном времени могут одновременно наблюдать несколько параметров метаболизма клеток и поддерживать автоматизацию культуры АЛИ.Микроуправление потокомС Система. В этом исследовании мы предложили такую тестовую систему: тканевые чипы (tissue - on - a - chip) связывают клетки ALI - культуры (рисунок 1). С помощью биочипов и 3D - печати закрытых полостей культивирования успешно культивируется 3D - реконструкция человека.Тонкая кишкаМодель.

В этой работе мы предложили трехканальную, полностью автоматизированную систему измерения тканевых чипов.(ИМОЛА-ИВДГермания,Селлас)Система может измерять трансэпителиальное клеточное сопротивление (TEER), чтобы получить более глубокое понимание организационных форм и барьерных свойств эпителиального клеточного слоя. Примечательно, что по сравнению с одноканальной чипсетной системой, описанной ранее, система имеет автоматический ALI в каждом из трех каналов, используя меньше клеточных питательных сред (Alexander et al. 2018). Таким образом, теперь можно проводить параллельные эксперименты на трех чипах одновременно, например: тестируемые предметы, контрольные и пустые.

Материалы и методы

3D модель ткани человека

Эксперимент был основан на реконструированной трехмерности.Кишечная тканьЭпикишечное- FT. Эта 3D - ткань, основанная на клетках человека, объединяет эпителиальные клетки кишечника, клетки Paneth, M - клетки, кластерные клетки иТонкая кишкаСтволовые клетки и люди.Тонкая кишкаФибробласты, которые культивируются в симулированных физиологических условиях АЛИ.ЭпикишечноеМодель FT может быть использована для обозначенияТонкая кишкаРазличные аспекты функции, включая барьерную функцию, метаболизм, воспаление и токсические реакции (Айехунии др. , 2018）。

МикрофизиометрическиеСистема

ГерманияСелласКорпоративныйIMOLA - IVD является автоматизированнымМикроуправление потокомСистемно расширенная микрофизиологическая измерительная система (Brischwein and Wiest, 2019). Подробные настройки устройства описаны в предыдущем отчете (Weiss et al. 2013). Проще говоря, биочип оснащен двумя резистивными датчиками с перекрестной электродной структурой, двумя электрохимическими pH - датчиками, датчиком кислорода тока и датчиком температуры. Измерения с датчиков записываются в цифровом виде иПрограммное обеспечение Data Acquisition and Link Application (ДАЛИА) Программное обеспечение. Программа отвечает за обработку данных жидкости и управление потоком, используя индивидуальный протокол открытия / выключения для управления ползучими насосами иМикроуправление потокомСистема (клапан на двустороннем стыке). С помощью этих инструментов можно параллельно контролировать 6 каналов IMOLA - IVDs, одновременно получая данные в режиме реального времени для сравнительного анализа, такие как тесты и отрицательные / положительные контрольные каналы.

Для лучшего использования и обслуживания IMOLA - IVD и ALIАлександр и др.(2018) Разработан новыйЗакрытая культураЦиньДизайн,использоватьUltimakerПечать на 3D принтере.полиэстерПрисоединяйтесь к биочипу. С этим.Закрытые полости культивированияМожно создать два разныхМикроканал: СтатьяВ культивированииЦиньВерхняя часть, одна из которыхВоспитаниеЦиньБоковая сторона. Через одинВерхнее золотоЭлектрический и боковой золотой датчики могутИзмерять вТрансуэллПолупропроницаемая камера культивирует трехмерную ткань TEER.

Частота измерения TEER составляет 10 кГц, плюс напряжение 30 мВ. Биологические чипы, соединяющие герметичную полость с головкой струи, используемой для корневой линии, показаны на рисунке 1. Сочетание упакованных биочипов и каналов потока, как показано на рисунке 1. Полная настройка показана на рисунке 2. IMOLAсуппоСистема rt (ISS - 3) включает системы IMOLA для управления потокомДорожная системаОткрыть клапанВыключение, а также электронное оборудование, используемое для записи данных детектора пузырьков, обеспечивают питание.

ДАЛИАКлиентское программное обеспечение используется для управления данными измерений и записи. Системы IMOLA, такие как насосы, проточные модули и клеточные питательные жидкости, установлены в универсальных клеточных инкубаторах, чтобы гарантировать, что весь эксперимент37?C. Каждый из трех каналов имеет два потока: один - верхний, а другой - боковой, как показано на рисунке 3. Оба пути могут быть использованы для инъекции различных веществ в клеточную среду, таких как питательные среды и тесты. В этой статье верхний поток может вводить два разных вещества: базовую питательную среду и тест. Во время измерений TEER низкобуферная среда LBM добавляется в верхнюю часть культивируемой ткани, создавая проводящее соединение между верхней и нижней стороной (жидкий интерфейс). Кроме того, верхняя часть покрыта тонким слоемСреда(Воздушный интерфейс) (200 нм). Боковые течения фундамента регулярно вводят новые питательные вещества на внешние стороны фундамента культивируемой ткани. В этом исследовании потокДорожная системаСвязь показана на рисунке 3. Номер один.Клапаны используютсяЗамена верхних питательных сред; Номер два.Клапан отвечаетВставить верхнюю часть культивирующей камеры для заполнения или опорожнения; Клапаны 3 и 4 вводят питательную среду на верхней и нижней сторонах, соответственно, в биочипы или бутылки с жидкими отходами, а клапаны 5 и 6 переключаются на фильтрованный воздух. Один IMOLA - IVD использует шесть клапанов и четыре насосных канала, управляемых в одностороннем режиме. Представленное здесь устройство использует три модуля IMOLA - IVD для параллельного изучения трех культивирующих камер (три биочипа, каждый из которых имеет верхнюю и базовую стороны).

Подготовка к проверке

Проверить потокДорожная системаНастройка и измерение, можно использовать фосфатный буфер (PBS)Провести предварительный эксперимент.. Для верхней и нижней сторон фундамента используется осмотическое давление 300 ± 10%МОСМОЛ/ кг раствора PBS, испытываемого веществом 1000 ± 10% через верхний проходМОСМОЛ/kg的PBS溶液。

Подготовка анализа дляЭпикишечноеТММодель

Прежде чем начать, организуютПредварительная культурапостабильныйСтатус. Затем введите 5 мл в боковую питательную среду SMI - 100 - FT - MM (MatTek in Vitro). Life Science Laboratories)； Добавление 200 мкл SMI - 100 - MM (Mattek in Vitro Life Science Laboratories). А потом...37?Cи5% CO2По крайней мере, культивирование24 ч 00 м. Перед экспериментом вся система была стерилизована иПредварительное орошение питательной жидкости. Все трубопроводы и верхние проходыБолее 2,5% гипохлорной кислоты (Sigma Aldrich, # 71696, Diluted with double - distilled H2O) Дезинфекция в течение 20 минут для стерилизации, биочип - уплотнительная полость путем проникновения 70% этанола в течение 20 минут для стерилизации. Затем боковая и верхняя стороны фундамента вводят питательную среду, в трубопроводВыполнение предварительного орошенияОбработка. Поместите всю систему и питательную среду37?CИ 5% CO2 в инкубаторах на ночь. Наконец, будет содержатьТонкая кишкаКультурные камеры тканей размещаются на стерилизованных биочипах. Использование боковых каналов фундамента

SMI-100-FT-MM (Маттек Ин Витро Наука о жизни)Laboratories)。 Верхнее течениеИспользование дорогБез буфера (СелласГМБХ,КронбургГермания: SOP-G200-006; СмотретьДополнительные материалы) и тесты, растворенные в DMEM.

Последнее использование додекаалкила * (SDS) с концентрацией 0,2 или 2,0% в качестве разрушения 3DТонкая кишкаОрганизационный барьер вещества. В течение заранее установленного цикла орошения определяется хронология двух каналов жидкости. Период измерения TEER включает в себя: 35 - минутный ALI, 10 - минутный TEER и 15 - минутный цикл очистки. Первый цикл АЛИ для жидкостных системВнутреннее предварительное орошениеУстановите программу на каждый цикл в течение 1 часа с непрерывным потоком в течение 24 часов. На 8 - й час верхняя среда заменяется средой, содержащей 0,2% SDS, которая циркулирует в течение одного цикла, а затем заменяется средой, не содержащей SDS.

Результаты

Проверка процедуры измерения и системы жидкости

каждыйТИЕРЦикл измерения состоит из фазы измерения и фазы промывки, и последовательность циклических процедур гарантирует, что изменения в течение всего периода мониторинга, безусловно, вызваны объектом, подлежащим измерению. каждый разТИЕРВ начале измерений верхняя часть культивируемой камеры пуста и медленно заполняется соответствующей средой. После достижения достаточного объема,ТИЕРЭлектроды погружаются в соответствующую среду и начинают достаточно измерять сопротивление. использоватьПБСМетод систематической проверки раствора4А.ТИЕРКонечным стандартным значением амплитуды является244Ω. Затем добавить тестовый предмет, электропроводность иПБСПо сравнению с увеличением, значение амплитуды сопротивления падает до132Ω.Повторное впрыскиваниеПБСПосле разбавления испытуемого, затем высасывается. Если нет второй инъекцииПБСТесты будут оставаться в среде культивирования и продолжать влиять на клетки. Как показано на рисунке4Как показано, для удаления испытуемого требуется два цикла очистки. Результаты показали,ИМОЛА-ИВДРазлив установкиПоточная системаИ датчики работают нормально на протяжении всего процесса измерения. Таким образом, можно сделать вывод, что датчик точно стабилен, а изменение амплитуды соответствует инъекцииПБСИзменяется осмотическое давление.

Контрольные эксперименты

Чтобы проверить эту настройку, на IMOLA был разработан тестовый эксперимент с положительным и отрицательным контрастом. Мониторинг значения TEER в тканях тонкого кишечника без добавления каких - либо веществ в течение 20 часов (с отрицательным контрастом), затем на 2,0% SDS теньМониторинг под шум 20 - 28 часов (положительный контраст). Измерения TEER проводятся каждый час. В каждом цикле измерений можно использовать значения TEER.

Средние значения периода платформы на более позднем этапе измерений PBS представлены, как показано на рисунке 4. Средние значения этих периодов платформы были объединены в последовательную диаграмму данных TEER. На рисунке 5 показаны размеры и фазы значений TEER (слева), а также реальные и виртуальные части (справа).

Значения TEER обычно показывают только размер, но, чтобы показать все измеренные значения, измеренное сопротивление полностью отображается в двух общих системах координат, то есть размер и фаза указываются в полярных координатах (слева), а реальность и виртуальная часть - в декартовых координатах (справа). Математические выражения приведены в формуле 1:

Модель ткани на чипе

В Figure 6 добавлено 0,2% SDSКишечная тканьМодель. После первых пяти часов TEER достиг среднего значения 270 Омега. Добавление тестируемого SDS на 8 - й час, TEER быстро поднимается, а затем линейно уменьшается до 18 - го часадо225 раз. Важно отметить, что SDS не изменяет концентрацию осмотического давления в клеточной питательной среде. Измеренные концентрации осмотического давления в среде с 0, 0,2 и 2,0% SDS (OSMOMAT 030)Гонотек, Berlin, Germany) в основном совпадает (300 ± 5%)МОСМОЛв килограммах).

ВЫВОД

Здесь мы предлагаем принципиальное доказательство того, что эксперимент использует трехканальную микрофизиологическую измерительную систему для измерения TEER и ALI для восстановления модели эпителия кишечника. Измерения параметров являются неинвазивными, в режиме реального времени, и система регулярно обновляет питательную среду автоматически. При измерении TEER культивируется комнатнаяВерхний тожеВведите питательную среду. Эксперименты по проверке PBS и 2.0% SDS также подтвердили это.Методы и системы измерения.

После добавления тестируемых предметов после 8 ч (0,2% SDS) было обнаружено, что TEER имеет тенденцию к снижению. В будущей работе мы рекомендуем провести последующие эксперименты с использованием тестеров и микродатчиков для получения данных о pH и растворенном кислороде (Wiest et). al.，2016)。

В целом, система IMOLA - IVD оказалась духом.Гибкость,Адаптируемые системы для анализа различных моделей клеточных культур, включая 2D - клеточную линию, прикрепленную к стенке, 3D - сфероиды, а также тканевые / органоидные чипы для восстановления эпидермиса и кишечника человека. Будущие работы будут включать в себя изучение и оптимизацию цикла орошения (например, увеличение времени периода стабилизации до испытательного вещества) и геометрии электродов, а также сбор спектрометрической информации (Gilbert et al. 2019; van). der Helm et al., 2019) исследовательский инструмент для создания многофункционального тканевого чипа, который может быть использован в моделях легких или других слизистых клеток.

Заявление о наличии данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, доступны по запросу соответствующего автора.

Вклад автора

Все перечисленные авторы сделали существенное, прямое и интеллектуальное вклад в работу и одобрил ее для публикации