Анализатор стабильности белка PSA - 16 помог исследователям из Института биологических исследований при Технологическом университете провинции Шаньдун опубликовать в апреле 2025 года в журнале International Journal of Biological Macromolecules статью « Structural - guided high stable fusion urate oxidase engineering to self - assemble with cellulose modified electrode for enhanced uric acid sensing».

Синбао Ван, Вэйли Гун, Юнлонг Сюэ, И Ю, Сяоцжэнь

Хуан, Юэ Шао, Сюань Ли, Синь Ван, Чунюй Сон, Бинглиан

Ван, Лихе Чжан, Яохун Ма

PII: S0141-8130(25)04227-8

Термическая стабильность белка - это способность к деформации полипептидной цепи белка под воздействием температуры, которая в основном отражается в химических свойствах полипептидной цепи при изменении температуры и изменении пространственной конфигурации, чем меньше изменение, тем выше тепловая стабильность. На термическую стабильность белков влияют различные температуры, pH, ионная прочность и другие внешние факторы, в биотехнологии, фармацевтических исследованиях и разработках, пищевой промышленности и других областях, имеет большое значение.

Температура дегенерации белка является важной концепцией для биологов, изучающих тепловую стабильность белка, когда он нагревается, когда его структура меняется, а белки переходят от стабильной трехмерной структуры к свободной неупорядоченной структуре. Термическая стабильность белка обычно выражается с использованием температуры плавления (melting temperature, Tm, также называемой температурой термодегенерации), то есть температуры, при которой белки распадаются на 50%.

01 Предисловие

Высокая стабильность и сохранение каталитической активности при фиксации оксидазы мочевой кислоты (UOX) является ключом к достижению точного датчика мочевой кислоты (UA). В этом исследовании был разработан электрохимический биодатчик UA на основе самосборки UOX, который облегчает обнаружение UA путем интеграции модуля связывания углеводов (CBM) на электродах, модифицированных целлюлозой. С помощью вычислительной структурно ориентированной стратегии ферментативной инженерии было доказано, что структурная стабильность слияния N - терминала CBM3 лучше, чем CBM3 или CBM2 слияния C - терминала. Дальнейшее удаление остатков на N - конце CBM3 (P2VSG5) и в зоне соединения (K158EPMSN163), которые были предсказаны как вредные для структурной стабильности CBM3 - UOX, позволило построить CBM3 - дельта 10aa - UOX, который значительно повысил надежность биодатчика UA по сравнению с биодатчиком UOX с пентадегидом (0 - 0375 мм, 5 дней), демонстрируя линейную зависимость в диапазоне от 0 до 0625 мА, R2 > 0.99， Устойчивость 20 дней. Кроме того, общая фиксация через дикие UOX и CBM3 - дельта 10aa - UOX (0 - 0875 мм, > 34 дня, R2 > 0.99）， Изучение механизмов, связывающих UOX с повышенным током на начальном этапе и объясняющих это взаимодействием между субъединицами UOX и разрывом связывающих пептидов, является еще одним доказательством того, что повышенная стабильность CBM3 - дельта - 10aa - UOX - ассоциированных пептидов может продлить процесс увеличения тока и увеличить продолжительность жизни. Это исследование подчеркивает эффективность самосборки в продвижении биодатчиков и предлагает надежную стратегию для эволюции подобных полимерных биодатчиков.

02 Резюме

Мочевая кислота (UA) является ключевым азотистым соединением, широко распространенным в биологических жидкостях, таких как сыворотка и моча, и является основным конечным продуктом пуринового метаболизма. Нормальный уровень UA в сыворотке крови здоровых индивидуумов составляет 0,21 - 0,43 мм для взрослых мужчин и 0,15 - 0,36 мм для взрослых женщин, соответственно, в то время как у пациентов с подагрой концентрация UA может достигать 1,49 - 4,46 мм. Аномальные уровни UA в жидкостях организма могут указывать на такие заболевания, как подагра, метаболический синдром и заболевания почек, что делает его полезным биомаркером для обнаружения заболеваний, связанных с пуриновым метаболизмом. Поэтому быстрое и надежное обнаружение UA в жидкости организма часто имеет решающее значение для его диагностики и лечения.

В настоящее время разработаны различные методы измерения UA, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC), спектрофотометрию, ионную хроматографию, масс - спектрометрию HPLC / изотопного разбавления (ID - MS) и электрохимические биосенсорные методы. В этих методах биодатчики ферментов токового типа, основанные на катализаторе окисления и восстановления на основе оксидазы мочевой кислоты (UOX или ферменты мочевой кислоты, EC 1.7.3.3), широко изучены из - за их простоты, чувствительности, специфичности и быстрой реакции. Уравнение реакции UOX выглядит следующим образом: UA + 2H2O + O2 мочевины + H2O2 + CO2. Во время биосенсорного процесса UOX, прикрепленный к электроду, реагирует с UA, потребляя O2 и генерируя H2O2. Уменьшение концентрации O2 или окисленного H2O2 пропорционально концентрации UA, и сигнал окисления или восстановления может быть преобразован и увеличен до читаемого физического сигнала с помощью преобразователя и электронного усилителя. Таким образом, высокая стабильность фиксации UOX и поддержание каталитической активности являются ключом к достижению точной чувствительности UA.

В предыдущих исследованиях для создания токовых биодатчиков UA использовались различные типы ферментативной фиксации. Физическая адсорбция и инкапсуляция обычно используются для фиксации UOX, но их адсорбционные процессы имеют слабую связь и подвержены изменениям окружающей среды, что снижает стабильность работы и хранения соответствующих биодатчиков. Захоронение пакетов UOX обычно осуществляется с использованием полимеров, таких как полистирол (PANI) и полипиррол. Однако утечка стационарных ферментов из этих полимеров может повлиять на их стабильность. Метод ковалентного связывания и скрещивания с использованием двухфункциональных реагентов, таких как глутальдегид или карбодиамин, для формирования стабильных ковалентных связей между ферментом и носителем или белком сыворотки крупного рогатого скота (BSA) также является распространенным методом химической фиксации UOX, который позволяет избежать десорбции и утечки ферментов. Однако широкая энзимная инактивация и низкая повторяемость, вызванные ковалентной связью, ограничивают ее применение в биологических датчиках. В последнее время аффинная адсорбция оказалась перспективной стратегией фиксации ферментов, которая улучшает производительность ферментных биодатчиков. Кроме того, модуль связывания углеводов (CBM2) из семейства 2 сливается с оксидазой глюкозы с помощью генной инженерии для повышения чувствительности глюкозы. Тем не менее, структура и каталитические механизмы UOX отличаются от оксидазы глюкозы, поэтому изучение создания стабильного и активного CBM - слияния UOX в качестве биосенсорного компонента UA по - прежнему имеет решающее значение.

UOX представляет собой функциональную четырехмерную бочкообразную структуру с активными участками, образованными остатками интерфейса из двух мономеров. Каждый мономер содержит два одинаковых структурных поля с антипараллельной сверхвторичной структурой β - β - α - β, называемой туннельной складной структурой. Некоторые слабые взаимодействия (нековалентные, вторичные), в том числе Ван дер Ваальс, водородные, солевые (диссоциирующие) и гидрофобные взаимодействия, участвуют в стабилизации четырехуровневой структуры. Кроме того, взаимодополняющее расположение полярных и гидрофобных групп, образующихся между субъединицами, способствует корреляции конкретных субъединиц. В каталитическом процессе UOX для продвижения и контроля химии O2 без вспомогательных факторов были предложены различные каталитические механизмы, аналогичные флавоноидно - зависимым оксидазам или флавоноидно - зависимым монооксидазам, но механизмы их действия еще не определены. Из - за аддитивной каталитической активности UOX и нечетких каталитических механизмов за последние несколько десятилетий сообщалось о меньшем количестве инженерных UOX с улучшенной производительностью. Поэтому построение стабильного генетического слияния UOX является серьезной проблемой.

Последовательное слияние является популярной и жизнеспособной стратегией для создания синтетических сливающихся белков. При использовании этой стратегии для получения идеального сливающегося белка следует тщательно рассмотреть два элемента: оптимальный порядок размещения домена между партнерами по слиянию и выбор подходящего связующего элемента для соединения домена структуры белка. Слепая конструкция слияния белков может привести к множеству неблагоприятных последствий, включая неправильное сложение домена, низкую выработку белка и снижение биологической активности. Благодаря значительному развитию вычислительных программ, предназначенных для прогнозирования структуры белка и разумного проектирования белка, таких как AlphaFold2, PROCHECK, AutoDock Vina и GROMACS, можно лучше понять структуру слияния белков и избежать многих неблагоприятных результатов.

03 Результаты

Чтобы получить более полное представление о структуре всех UOXs,авторДля определения тепловой устойчивости используется дифференциальная сканирующая флуоресценция (DSF) [34]. Как показано на рисунке S7, пиковые формы UOX - CBM3 и UOX - CBM2 более асимметричны, особенно UOX - CBM2, что указывает на то, что разрывы CBM и UOX вызывают синергическую денатурацию нескольких структурных доменов. Напротив, пик DSF CBM3 - дельта 10aa - UOX является наиболее симметричным и узким, что подтверждает его структурную стабильность, что согласуется с результатами молекулярного динамического моделирования и анализа SDS - PAGE.

04 Способы

Для оценки термической стабильности целевого белка использовался анализатор стабильности белка PSA - 16 компании Beijing Baister Technology Co., Ltd. Сначала образец разбавляют до концентрации 0,5 мг / мл. Затем 20 микролитровый разбавленный образец помещается в кварцевую стеклянную трубку (номер продукта LG - 002, также от Beijing Baister Technology Co., Ltd.).

Для измерения интенсивности флуоресценции эндогенных белков на участках 330 нм и 350 нм используется линейное температурное сканирование. Температура колеблется от 23 до 97°C, а скорость нагрева - 1°C в минуту. Средняя температура термической денатурации (Тм) рассчитывается на основе наклона кривой F350 / F330. Каждый образец измерялся четыре раза.

05 Результаты

В этом исследовании авторы построили ряд CBM - слияния оксидазы мочевой кислоты с помощью стратегии ферментативной инженерии, ориентированной на структуру, и изучили ключевые факторы, влияющие на стабильность слияния UOX в качестве биосенсорного элемента, и показали, что область междоменной якорной привязки между N - концевыми остатками CBM3 (P2, V3, S4, G5) и 158 - 163 битами (K158EPMSN163) имеет решающее значение для стабильности структуры CBM - слияния UOX. После удаления нестабильных остатков надежность биодатчика UA значительно повысилась. Это исследование помогает рационально построить конвергентный UOX с гармоничными и предсказуемыми характеристиками и предлагает идеальных кандидатов для создания превосходного биодатчика UA.

Чтобы получить более полное представление о структуре всех UOX,авторОпределение тепловой устойчивости проводилось с использованием дифференциальной сканирующей флуоресценции (DSF) [34]. Как показано на рисунке S7, пиковые формы UOX - CBM3 и UOX - CBM2 более асимметричны, особенно UOX - CBM2, что указывает на синергическую денатурацию нескольких структурных доменов из - за разрыва CBM и UOX. Напротив, пики дифференциальной сканирующей флуоресценции (DSF) CBM3 - дельта 10aa - UOX являются наиболее симметричными и узкими, что подтверждает их структурную стабильность, как показывают моделирование молекулярной динамики (MD) и электрофорез декаалкила * - полиакриламида геля (SDS - PAGE).