I. Оптимизация основных целей

　　многоканальный полипептидный синтезаторОсновным преимуществом является « параллельный синтез, массовое производство», оптимизация эффективности должна быть развернута вокруг « повышения успешности одноканального синтеза, сокращения многоканального синхронного цикла, снижения потерь побочных реакций», в предпосылке обеспечения чистоты полипептидов (обычно ≥95%) для достижения синтетической продукции более высокого качества полипептидов за единицу времени, контролируя затраты на потребление реагента.

Оптимизация синтетических параметров: точное регулирование для повышения эффективности реакции

Оптимизация параметров активации аминокислот

Соотношение активационного реагента и концентрации: регулировка системы активации в соответствии с типом аминокислоты (гидрофобный / гидрофильный, альфа - спираль / бета - складная склонность), например, при синтезе нерастворимых аминокислот (например, валериана, лейцина), с использованием системы активации HBTU / HOBt / DIEA, активированный реагент и молярная бита аминокислоты поднимаются до 1,2: 1.0, концентрация контролируется на уровне 0,2 - 0,4 моль / л для обеспечения полной активации; Обычные аминокислоты могут быть использованы в системе DIC / HOBt, а морби 1.0: 1.0 может удовлетворить спрос и сократить отходы реагентов.

Контроль времени активации: обычное время активации аминокислот при комнатной температуре 3 - 5 минут, аминокислоты, содержащие бета - ветви или ароматические боковые цепи (например, изолейцин, фенилаланин), должны быть увеличены до 5 - 8 минут, чтобы избежать неполной активации, приводящей к снижению эффективности конденсации; После активации подача материала должна быть завершена в течение 30 минут, чтобы предотвратить разложение активированного промежуточного вещества.

2. Оптимизация параметров реакции на конденсацию

Температура и время реакции: обычный полипептидный синтез с использованием реакции при комнатной температуре (25 ± 2°C), время одноступенчатой конденсации 20 - 30 минут; Для полипептидов с пространственным сопротивлением (например, последовательности, содержащие несколько проламинов, трет - бутиловых защитных радикалов) температура может быть повышена до 37°C, время конденсации может быть увеличено до 40 - 60 минут, или скорость преобразования реакции может быть повышена с помощью режима секционного нагрева (сначала комнатная температура 10 минут, затем 37°C 30 минут).

Выбор и количество растворителя: растворитель на основе DMF, при синтезе гидрофильных полипептидов можно добавить 10 - 20% DMSO для повышения растворимости; При многоканальном синхронном синтезе количество растворителя в каждом канале должно быть точно контролировано в 5 - 8 раз больше объема смолы, чтобы убедиться, что смола полностью растворена, реагент и смола контактируют равномерно, чтобы избежать локальной реакции неполной из - за нехватки растворителя.

3. Оптимизация параметров снятия защиты

Концентрация и время обеззараживания реагента: использование 20% - ного раствора пиперидина / DMF в качестве обеззараживающего реагента, обычная последовательность обеззараживания 10 - 15 минут; Для аминокислот, содержащих трудноразрешимые группы, такие как Fmoc - Arg (Pbf), Fmoc - Asn (Trt), концентрация пиперина может быть увеличена до 25% или в два этапа снятия защиты (первые 5 минут, после добавления нового реагента после снятия защиты в течение 10 минут), чтобы обеспечить скорость снятия защиты ≥99%, чтобы избежать последующего конденсации воздействия остаточных защитных радикалов.

Оптимизация процесса промывки: после обеззараживания промывание DMF 3 - 5 раз, объем каждой промывки в 6 раз больше объема смолы, время промывки 30 секунд / раз, в то же время включение многоканальной синхронной перемешивающей функции, повышение эффективности промывки, уменьшение остаточной аминокислоты, вызванной пиперидином.

III. Многоканальная синергическая оптимизация: избежание узких мест синхронизации

1. Сбалансированное проектирование нагрузки канала

В зависимости от канала распределения длины и сложности полипептидных последовательностей короткие последовательности (10 аминокислот) и длинные последовательности (≥20 аминокислот), легко синтезируемые последовательности и трудно синтетические последовательности перекрестно распределяются по различным каналам, избегая того, чтобы один канал замедлял общий цикл синтеза из - за слишком длительного времени реакции. Например: 4 - канальный синтез, 2 канала синтезируют 15 пептидов (обычная сложность), 1 канал синтезирует 25 пептидов (высокая сложность), 1 канал синтезирует 8 пептидов (легко синтезируется), через рациональное распределение для достижения многоканальной приближенной синхронизации завершения.

2. Оптимизация поставок и распределения реагентов

Предварительная подготовка реагента: при массовом синтезе одного и того же типа полипептидов предварительно смешивайте активированный реагент и раствор аминокислоты по количеству каналов, используйте специальные баллоны реагента после раздельной загрузки, чтобы иметь соответствующий доступ к каждому каналу, чтобы избежать одноканальной подготовки один за другим, чтобы тратить время, обеспечивая при этом одинаковую концентрацию реагента в каждом канале.

Проверка трубопроводов и клапанов: перед синтезом проверьте, гладкий ли многоканальный распределительный трубопровод реактива, чувствительна ли реакция переключателя электромагнитного клапана, чтобы убедиться, что ошибка подачи реагента в каждом канале составляет ±2%; Для легко кристаллизуемых реагентов (например, HBTU) необходимо оборудовать изоляционный чехол (температура 25 - 30°C) за пределами баллона реагента, чтобы предотвратить засорение кристаллом трубопровода, что приводит к неравномерному подаче материала.

Градиент потепления и синхронного контроля

Для случаев запаздывания реакции некоторых каналов в многоканальном синтезе может быть использована стратегия градиентного потепления: для каналов с более медленной реакцией повышение температуры (не более 40°C) в индивидуальном порядке, в то же время с помощью операционного программного обеспечения, чтобы установить режим « приоритетная подача материала в канал с запаздыванием», в предварительном снятии защиты, шаг стирки для канала с запаздыванием экономит 1 - 2 минуты, чтобы обеспечить окончательную многоканальную синхронизацию для завершения реакции конденсации и сокращения времени ожидания.

IV. Оптимизация управления оборудованием и реагентами: создание прочной основы эффективности

1. Предварительная обработка и техническое обслуживание оборудования

Перед синтезом включите функцию подогрева оборудования, стабилизируйте температуру реакционного отсека на заданном значении (±0,5 °C), а также калибруйте многоканальное перемешивающее весло, чтобы убедиться, что скорость перемешивания каналов одинакова (ошибка 5 rpm), чтобы избежать локальной разницы в эффективности реакции из - за неравномерного перемешивания.

Регулярно (по 50 партий на синтез) очищайте распределительные трубопроводы реагента и реакторы, поочередно промывайте их DMF и метанолом 3 раза, удаляйте остаточные аминокислоты и осадки реагента, предотвращая засорение трубопровода или перекрестное загрязнение, обеспечивая эффективность доставки реагента.

2. Качество реагентов и управление запасами

Выбирайте реагенты высокой чистоты (чистота аминокислот ≥99%, чистота активированного реагента ≥99%), чтобы избежать примесей, приводящих к увеличению побочных реакций; Хранение реагентов должно быть классифицировано в соответствии с требованиями: твердое аминокислотное уплотнение после замораживания - 20°C, жидкий реагент (например, пиперидин, DMF) для сохранения при комнатной температуре и после вскрытия в течение 3 месяцев после использования.

Проверьте состояние реагента перед использованием: содержание воды в DMF должно быть 0,05% (может быть проверено методом Карла Фишера), активированный реагент не имеет сгустков, обесцвечивание, если реагент не подходит, необходимо своевременно заменить, чтобы избежать снижения эффективности синтеза или неудачи из - за проблем с реагентом.

V. Специальная стратегия оптимизации эффективности сложных последовательностей

Гидрофобные полипептиды: повышение растворимости полипептидов с использованием "системы антифазных растворителей" (DMF / дихлорметан = 7: 3) с добавлением 0,1% трифторэтилового спирта в качестве растворителя; При конденсации используется метод « двойной активации» (сначала активация HBTU, а затем добавление небольшого количества PyBOP для повышения реактивной активности), время одноступенчатой конденсации увеличивается до 60 минут.

Содержит несколько повторяющихся аминокислотных последовательностей: например, poly - gly, poly - ala, добавьте один шаг « предварительной промывки» (2 промывки смолы DCM) перед повторным подачей аминокислоты, чтобы уменьшить остаточные остатки защитных радикалов на поверхности смолы; В то же время снижайте температуру конденсации до 20°C, избегая ротации аминокислот, вызванной высокой температурой.

Циклопептидный синтез: на стадии циркуляции применяется « система реакции высокой концентрации» (концентрация смолы повышается до 0,1 г / мл), добавляется каталитическое количество HOAT (0.1eq), а циклический реагент добавляется методом « медленного капельного добавления», время добавления капель контролируется в течение 10 - 15 минут, что повышает эффективность кольцевой реакции и уменьшает остатки линейных пептидов.

Оптимизация проверки и корректировки эффективности

После каждой оптимизации эффект должен быть проверен по трем показателям: (1) эффективность синтеза (количество квалифицированных полипептидных партий, выполненных за единицу времени); 2) полипептидная чистота (с помощью теста HPLC, целевая чистота ≥95%); Удельный расход реагента (потребление реагента на синтетический полипептид 1 ммоль). Если индикатор не соответствует стандарту, параметры должны быть скорректированы целенаправленно: если чистота недостаточна, оптимизировано время снятия защиты или конденсации, эффективность не улучшена, а распределение нагрузки канала или рабочее состояние оборудования проверяются, чтобы убедиться, что оптимизированный план посадки эффективен.