Общие проблемы, которые могут возникнуть в ходе экспериментов с полностью автоматизированной системой иммунопринтинга белков, включают в себя слабый или нулевой сигнал, высокий фон, многополосные явления, аномалии полос и т. Д. Ниже приводится подробный анализ этих проблем:
Слабый сигнал или отсутствие сигнала
i) Сопоставимость между i и ii: ii) Сопротивление идентично одному и тому же виду, что и i - анти - хозяин, например, i - от крысы, а ii - от крысы.
Недостаточная концентрация антител: использование высокой концентрации антител и увеличение времени инкубации при 4°C, например, ночная инкубация.
Герметики пересекаются с антителами: используйте мягкие дезактиваторы, такие как Твен - 20, или замените герметики (например, обезжиренное молоко, BSA, сыворотка, желатин).
i) белки против неидентифицируемых видов, подлежащих проверке: со ссылкой на инструкции, сравните последовательность иммуногена и последовательность белка, чтобы убедиться, что антитела и белки - мишени будут реагировать, и установите положительный контроль.
Недостаточное количество образцов белка: количество проб белка в каждом канале обычно не превышает 20 мкг, используются ингибиторы протеазы и устанавливается положительный контроль.
Недостаточная трансформаторная мембрана: использование обратимого красителя для обнаружения эффекта трансформаторной мембраны, проверки правильности операций трансформаторной мембраны, например, PVDF мембрана должна быть предварительно погружена в метанол, а затем погружена в переходный буфер.
i) Устойчивость к отказу: использование свежих антител во избежание повторного использования приводит к снижению эффективной концентрации.
ii) анти - ингибирование азидом натрия: избегайте использования азида натрия вместе с антителами HRP.
Обнаружение устаревших наборов реагентов или инактивации субстрата: использование свежих субстратов.
Высокий фон
Специальное закрытие не проводится или недостаточно закрыто: продлевается срок закрытия, рассматривается возможность замены подходящего герметика.
Превышение концентрации I - или II - анти: разбавление антител до подходящей концентрации или увеличение времени инкубации антителами с более высокой степенью разбавления.
ii) Неспецифическое сочетание или реакция сопротивления и герметика: Установите двойной контраст (без добавления одного сопротивления).
Недостаточная промывка без связывания белков: увеличение количества стирок.
Сухая мембрана: во время инкубации, чтобы предотвратить высыхание мембраны, каждый шаг должен гарантировать, что мембрана имеет достаточную реакционную жидкость, которая может быть помещена в миксер, чтобы постоянно перемешивать или мягко сотрясать мембрану, чтобы погрузить ее в раствор.
Неправильный отбор мембраны: нитратная целлюлозная мембрана (NC - мембрана) ниже, чем фон мембраны PVDF, и подходящая мембрана может быть выбрана в соответствии с экспериментальными потребностями.
Многозонное явление
Клетки передаются слишком часто, и белки выражаются по - разному: используются оригинальные, не передаваемые штаммы клеток, и проводятся параллельные контрольные эксперименты с современными штаммами клеток.
Образец белка, экспрессируемый в организме, имеет множество модифицированных форм: ацетилирование, метилирование, алкилирование, фосфатирование, гликирование и т. Д., Можно использовать реагенты для дефосфатирования образца, десахаридизации, чтобы доказать переведенную модификацию.
Деградация образцов белка: Добавление достаточного количества ингибиторов протеазы в буфер образца.
Обнаружены неизвестные новые белки или белки одного и того же семейства с аналогичными поверхностными позициями и другой структурой: обратитесь к другим источникам литературы или используйте BLAST для поиска, используя штаммы клеток или ткани, рекомендованные в инструкции.
i) Высокая устойчивость к концентрации: снижение концентрации антител и / или время инкубации.
Аномалия полосы
На заднем плане есть неравномерные белые пятна: при пересадке мембраны на мембране есть пузырьки или антитела, которые неравномерно распределены по мембране, во время пересадки мембраны следует стараться удалить пузырьки, антитела остаются колеблющимися при инкубации.
На заднем плане есть черные пятна: антитела связывают герметики и могут фильтровать герметики.
На глубоком фоне появляются белые полосы: один или два антигена добавляются слишком много, концентрация антител должна быть разбавлена.
Крашение полосы назначения слишком низкое / слишком высокое, разделение неполное: изменение соотношения геля, белки с большой молекулярной массой с низкой концентрацией клея, белки с малой молекулярной массой с высокой концентрацией клея.
Эффект « улыбки» полосы: слишком быстрая миграция или слишком высокая температура электрофореза изменяют pH и скорость миграции, снижая скорость миграции или криогенный электрофорез (например, в холодильнике или на льду).
Те же белки гибридизируются с неравномерной полосой: гель слишком быстро затвердевает при приготовлении геля, что приводит к неравномерному соотношению акриламида в канале, можно ссылаться на формулу геля, добавлять умеренное количество TEMED в гель, при размещении добавлять соответствующее количество 1% SDS (разбавление воды) в верхнюю часть геля, чтобы предотвратить высыхание геля.