Технические принципы и рабочие процессы многоканального отечественного белкового принтера (WesternBlotting Instruments) в основном зависят от его способности эффективно и точно обнаруживать белки. Белковый отпечаток (WesternBlot) - это экспериментальная технология для обнаружения и анализа экспрессии конкретных белков, которая широко используется в молекулярной биологии, медицинских исследованиях и других областях.
Ниже приведены технические принципы и процессы работы многоканального отечественного белкового принтера:
Технический принцип
Основной принцип белкового следа заключается в разделении белка в образце по молекулярной массе с помощью гелевого электрофореза и переносе разделенного белка на мембрану через мембрану. Затем, связываясь с конкретными антителами на мембране, обнаруживается наличие и экспрессия белка.
Многоканальный протеиновый принтер в основном повышает эффективность эксперимента за счет параллельной обработки нескольких каналов проб в одном приборе. Основные технические принципы включают:
Разделение белков:
Гелевый электрофорез (SDS - PAGE): белки в образцах отделяются электрофорезом с помощью полиакриламидного геля, белки с меньшей молекулярной массой перемещаются в электрическом поле быстрее, а более крупные белки перемещаются медленнее, что приводит к разделению по размеру.
Передача белка:
Трансферная мембрана: путем электрического переноса (электрофореза) отделенный белок переносится из геля на мембрану (обычно поливинилдифторидную PVDF - мембрану или нитратную целлюлозу мембрану). Белки на мембране фиксируются в определенном месте.
Тестирование белков:
Инкубация с антителами: Используя специфические антитела (обычно антитела против белка - мишени), антитела связываются с белком - мишенью на мембране.
Химическая люминесцентная или выраженная цветовая реакция: вторичные антитела, помеченные ферментами, связываются с целевым белком и генерируют сигналы посредством химической люминесцентной или яркой реакции, которая обнаруживает наличие и экспрессию белка с помощью системы визуализации.
Многоканальная технология:
Многоканальный протеиновый принтер, основанный на традиционном одноканальном белковом отпечатке, может обрабатывать несколько каналов проб одновременно в одном и том же эксперименте. Это достигается с помощью нескольких пробоотборных отверстий и параллельных операций, что повышает эффективность экспериментов и сопоставимость данных.
Операционный процесс
Процесс работы многоканального отечественного белкового принтера обычно включает в себя следующие основные этапы:
1. Подготовка образцов
Отбор образцов клеток или тканей для тестирования.
Используйте крекинговый буфер, чтобы разбить клетки и извлечь белки.
Полученные белки количественно измеряются, чтобы убедиться, что в каждый образец добавляется равное количество белков.
2. Электрофорез SDS - Page
Подготовка полиакриламидных гелей, как правило, с использованием геля SDS - PAGE, SDS (додекаалкилсульфат натрия) используется для разрушения структуры белка, так что он имеет отрицательный заряд и отделяется по размеру молекулы.
Образцы загружаются в гель, а в электрическом поле проводится электрофорез, который отделяет белки различной молекулярной массы.
3. Трансвертерная мембрана
Белки в геле переносятся на пленку PVDF или нитратную целлюлозу. Трансформаторный процесс обычно осуществляется посредством электрического переноса.
Используйте трансмембранные приборы (например, трансмембранные блоки в многоканальном белковом принтере) для регулировки тока, напряжения, времени передачи и других параметров, чтобы обеспечить эффективный и равномерный переход белка на мембрану.
4. Блокирование
Используйте закрытую жидкость (например, 5% обезжиренное сухое молоко или раствор BSA) для обработки мембраны, закрывая неспецифические связывающие участки и предотвращая связывание антител с другими частями мембраны.
5. Инкубация антителами
i) противоинкубационные: мембраны помещаются в антираствор, обычно специфические первичные антитела к белкам - мишеням. Продолжительность инкубации может варьироваться от часа до ночи в зависимости от характеристик антител.
ii) противоинкубационная селекция: инкубация с использованием вторичных антител, маркирующих ферменты (например, пероксидазу хрена HRP) или другие поддающиеся обнаружению молекулы для усиления сигнала.
6. Химическая люминесцентная проверка
Реагируя с использованием химических люминесцентных субстратов (например, реактивов ECL), ферменты HRP катализируют подсветку субстрата.
Используйте системы визуализации (например, химические светоизлучающие системы визуализации) для захвата светящихся сигналов и создания изображений для обнаружения белков.
Многоканальная конструкция многоканального белкового принтера позволяет одновременно захватывать сигналы нескольких образцов и повышать эффективность.
7. Анализ данных
В зависимости от яркости и размера обнаруженной полосы анализируется уровень экспрессии белка. Интенсивность полосы пропорциональна экспрессии белка - мишени.
Программное обеспечение используется для количественного анализа полос и сравнения со стандартными белковыми линейками для расчета относительной экспрессии белков.
Преимущества и особенности
Многоканальная параллельная работа: одновременная обработка нескольких образцов повышает эффективность работы и сопоставимость данных.
Высокая степень автоматизации: автоматическое управление трансформаторной мембраной, инкубацией антител, промывкой и другими шагами с помощью инструмента для уменьшения человеческой ошибки.
Высокая чувствительность и высокий поток: подходит для обнаружения белков с низким содержанием и может обрабатывать большое количество образцов.
Широкий диапазон применения: может быть применен к различным экспериментам, таким как анализ экспрессии белка, проверка специфичности антител, исследование белково - белковых взаимодействий и так далее.
заключение
Многоканальный отечественный принтер белка благодаря высокому и автоматизированному рабочему процессу значительно повышает эффективность и точность эксперимента по отпечатку белка. Он предоставляет исследователям более мощные и быстрые инструменты для обнаружения белка, особенно когда требуется одновременная обработка нескольких образцов.