Флуоресцентный количественный анализатор PCR контролирует изменения флуоресцентных сигналов в режиме реального времени, в сочетании с значением Ct и анализом стандартных кривых для достижения точной количественной оценки гена, его основные принципы и шаги реализации заключаются в следующем:

основной принцип

Включение флуоресцентных групп (например, красителей SYBRGreen или зондов TaqMan) в систему реакции на амплификацию PCR позволяет синхронизировать интенсивность флуоресцентного сигнала с увеличением производства. Каждый раз, когда завершается цикл PCR, прибор собирает флуоресцентный сигнал и генерирует кривую усиления. Устанавливая порог флуоресценции (обычно 10 - кратное стандартное отклонение от базового сигнала), определяется количество циклов (Ct), когда продукт усиления достигает порога. Значение Ct отрицательно коррелирует с начальным количеством шаблона, то есть чем больше начальный шаблон, тем меньше значение Ct.

Шаги реализации

Стандартная построение кривой: градиентное разбавление с использованием известных концентраций стандартных продуктов (например, очищенной плазмидной ДНК или транскрипционной РНК in vitro) и увеличение PCR с использованием стандартных продуктов с различными концентрациями в качестве шаблонов. логарифм числа копий стандартного продукта является горизонтальным, а значение Ct - вертикальным для построения стандартной кривой. Когда стандартная концентрация продукта находится в диапазоне 10 м2 - 10 м2 копий, концентрация шаблона обычно демонстрирует хорошую линейную зависимость от значения Ct (коэффициент корреляции R² > 0,99), обеспечивая точную количественную оценку в этом диапазоне.

Обнаружение неизвестной выборки: синхронное расширение неизвестной выборки со стандартным продуктом, вычисление количества копий целевого гена в образце в соответствии с его значением Ct в формуле стандартной кривой. Например, если стандартная кривая формула y = 3.1372x + 38.201 (y - значение Ct, x - логарифм числа копий), начальный размер шаблона выборки может быть получен путем обратного вычисления.

Корректировка эндометриального гена (относительная количественная величина): Когда необходимо сравнить различия в экспрессии генов между различными образцами, выберите гены домработницы (например, GAPDH, β - actin) в качестве эндометрия, а затем проанализируйте относительную экспрессию с помощью метода дельта - Ct, чтобы устранить влияние различий в количестве образцов и эффективности реакции путем расчета разницы Ct между целевым геном и эндометрическим геном (дельта - Ct).