[Обработка вспышек PCR]

- Да.

PCR (полимеразная цепная реакция) и гелевый электрофорез являются широко используемыми методами в молекулярных биологических исследованиях, которые часто используются в сочетании для идентификации и анализа продуктов амплификации PCR. Однако при проведении электрофореза с гелем PCR в электрофорезах часто обнаруживаются примеси, которые могут нарушить результаты эксперимента и даже привести к его провалу.

В этой статье будут рассмотрены причины возникновения смешанных полос во время электрофореза с гелем PCR и предложены некоторые возможные решения.

● ● ●

Оптимизация условий PCR:Настройка условий реакции PCR, низкая температура отжига может привести к неспецифическому соединению экстракта с шаблоном, вызывая неспецифическое расширение; Высокая температура отжига может препятствовать нормальному сочетанию экстракта с шаблоном, влияя на эффективность расширения. Оптимальная температура отжига может быть определена постепенно с помощью градиентных экспериментов PCR. В целом температура отжига на стадии реакции PCR обычно составляет от 50°C до 68°C, в зависимости от последовательности оснований экстракта и характеристик целевой ДНК. Некоторые экстракты требуют более высокой температуры отжига для обеспечения специфичного соединения в определенной области, но, как правило, максимальная температура отжига не превышает 68°C.

● ● ●

Дизайн экстракта неразумный:Если длина экстракта слишком коротка, последовательность повторяется или содержит область с высоким GC, это может привести к неспецифическому соединению экстракта с шаблоном, что, в свою очередь, приведет к образованию гетерогенных полос. Необходимо изменить структуру экстракта, с тем чтобы обеспечить правильную длину, неповторение последовательности, умеренное содержание GC, а также избежать появления областей с высоким содержанием GC внутри экстракта или в зоне соединения экстракта с шаблоном.

● ● ●

Неправильное использование цитат:Чрезмерное использование экстракта или его низкая специфичность могут привести к неспецифическому расширению, что приведет к образованию гетерогенных полос. Рекомендуется поменять или уменьшить использование экстрактов.

● ● ●

Шаблоны нечистые:Шаблонная ДНК содержит примеси, такие как белки, РНК или другие нецелевые фрагменты ДНК, которые могут использоваться в качестве шаблонов для расширения PCR, что приводит к появлению дополнительных полос.

● ● ●

Разложение шаблонов:Шаблонная ДНК разлагается в процессе извлечения или хранения, в результате чего образуются небольшие фрагменты ДНК, которые могут стать шаблонами для неспецифической амплификации.

● ● ●

Очистить шаблоны ДНК:Шаблонная ДНК в эксперименте PCR может быть получена из нескольких источников, включая геномную ДНК (gDNA), комплементарную ДНК (cDNA) и плазмидную ДНК. Тем не менее, ДНК из разных источников может различаться по составу и сложности, что влияет на оптимальную начальную величину амплификации PCR. Например, при 50 мкл реакции PCR для плазмидной ДНК требуется всего 0,1 - 1 нг, а для gDNA - 5 - 50 нг. Кроме того, используемый тип ДНК - полимеразы также влияет на оптимальный начальный уровень шаблона. Модифицированная ДНК - полимераза имеет более сильное сродство к шаблону и более высокую чувствительность, поэтому требуемый порог ДНК относительно невелик. Оптимизация исходного уровня ДНК имеет решающее значение, поскольку слишком высокий пороговый уровень может привести к увеличению риска неспецифической амплификации, в то время как слишком низкий пороговый уровень может привести к снижению частоты ПКР. Иногда экспериментальные схемы PCR используют количество копий для обозначения исходного количества ДНК, особенно для gDNA. Расчет числа копий включает в себя константу Авогадро и молярную массу по формуле: число копий = число L × моль = количество L × (общая масса / мольная масса).

● ● ●

Чрезмерно высокая концентрация Mg²:Mg² является важным компонентом реакции PCR, но его высокая концентрация снижает специфичность амплификации PCR и увеличивает риск неспецифической амплификации. Оптимальная концентрация Mg² должна быть определена экспериментальным путем.

● ● ●

Плохое количество или качество ферментов:Высокое использование ферментов или плохое качество ферментов могут повлиять на реакцию PCR. Рекомендуется уменьшить количество ферментов или заменить ферменты из другого источника.

● ● ●

Использование теплового запуска PCR:Термический запуск PCR может уменьшить неспецифическое усиление, которое может вызвать реакция при низких температурах.

Термоактивация PCR - это технология, используемая для уменьшения неспецифической амплификации. В обычном PCR, когда температура реакции повышается до температуры амплификации, экстракт может быть присоединен к ДНК шаблона. Это может привести к неспецифическому амплификации на начальной стадии PCR, вызывая смешанные или ложноположительные результаты. Термоактивация PCR решает эту проблему путем добавления термостабильной ДНК - полимеразы в реакцию PCR.

Ключом к тепловому запуску PCR является использование полимеразы, которая требует высокотемпературной активации. Такие ферменты становятся активными при более высоких температурах, поэтому они начинают увеличивать последовательность целевой ДНК в начале реакции, не вызывая неспецифических реакций при низких температурах.

Некоторые часто используемые термоактивные полимеразы включают улучшенные версии термостабильной Taq - полимеразы, такие как Taq DNA - полимеразы с термоактивными полями, а также высокоточные полимеразы, такие как Pfu или Phusion.

Таким образом, ферменты в основном удовлетворяют условиям.

● ● ●

Проверьте лабораторную среду:Избегайте загрязнения ДНК и лабораторных приборов, используйте стерильные технологии и обработанные реагенты, чтобы сохранить лабораторию чистой.

● ● ●

Градиентная оптимизация PCR:Используйте температурный градиент для реакции PCR, чтобы найти специфическое увеличение температуры.

Умный двухмерный градиентный PCRМожно одновременно оптимизировать дегенерацию и градиент температуры отжига в одной и той же реакции, можно установить поперечный 8 - строчный градиент дегенерации в вертикальном направлении может установить 12 столбцов температуры отжига, тем самым оптимизируя оптимальную температуру отжига, тем самым повышая специфичность и эффективность реакции PCR.

Эта технология очень полезна для оптимизации экстрактов, шаблонов и условий PCR, чтобы обеспечить получение высококачественных и специфичных продуктов PCR.

Эти методы могут использоваться индивидуально или в сочетании, чтобы помочь уменьшить или устранить проблемы с ПКР.