Тестирование белков с помощью ультрамикронуклеиновых анализаторов (например, ультрамикронуклеотидных белков) в основном основано на ультрафиолетово - видимой спектрофотометрии, которая оценивает их концентрацию путем измерения поглощения белка на определенной длине волны (например, 280 нм). Ниже приведены конкретные методы и ключевые этапы тестирования белков:
I. Принцип тестирования
Триптофан (Trp), остатки тирозина (Tyr) и дисульфидные связи Cys - Cys в белковых молекулах значительно поглощаются на длине волны 280 нм. Прибор непосредственно вычисляет концентрацию белка (мг / мл), измеряя поглощение белкового раствора на 280 нм (A280) в сочетании с законом Ламбера - Билла. Этот метод не требует построения стандартной кривой, но гарантирует, что образец не содержит других примесей (таких как нуклеиновые кислоты, фенолы), которые сильно поглощаются на 280 нм.
II. Оперативные шаги
Инструменты готовы.
Подключите питание, запустите прибор, подогрейте 5 - 10 минут до стабильного состояния.
Выберите режим обнаружения « белка A280» и установите световой путь (обычно 10 мм, но прибор может автоматически настраиваться).
Используйте дистиллированную воду высокой чистоты или пустой буфер для калибровки нуля, чтобы устранить фоновые помехи.
Обработка проб
Объем образца: рекомендуется использовать 2 - мкл образца (некоторые приборы поддерживают микрообнаружение 0,5 - 2 мкл), чтобы обеспечить формирование стабильных жидких колонн.
Избегайте пузырьков: точечный образец при легком касании дна испытательного отверстия, медленно высвобождение жидкости, чтобы предотвратить влияние пузырьков на измерение поглощения.
Поверхностное натяжение: Если поверхностное натяжение образца низкое (например, с дезактиватором), количество образца может быть увеличено до 4 мкл для обеспечения стабильности жидкой колонны.
Пустой контраст
Возьмите 2 мкл пустого раствора (например, буфер) и добавьте к нижней базе, опустите верхнюю базу и нажмите кнопку « Пустой», чтобы записать фоновую поглощение.
Протрите основание, чтобы убедиться, что нет остаточной жидкости.
Проверка образцов
Возьмите 2 мкл подлежащего измерению образца и добавьте его к нижней базе, опустите верхнюю базу и нажмите кнопку « образец».
Прибор автоматически измеряет поглощение и вычисляет концентрацию, результаты обычно отображаются в мг / мл.
Образцы с высокой концентрацией: если величина поглощения превышает диапазон прибора (например, интенсивность света < 200), то после разбавления образца его необходимо повторно проверить.
Регистрация и очистка данных
Сохранить результаты тестирования и экспортировать в формат CSV или PDF.
Протрите основание пыльной тканью, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
III. Ключевые вопросы, требующие внимания
Базовая калибровка
Базовая калибровка по умолчанию длины волны 340 нм, пользователь может настроить ее по мере необходимости.
Калибровка должна быть завершена до обнаружения образца, иначе спектральное значение будет смещено, что приведет к ошибке расчета концентрации.
Чистота образца
Избегайте содержания нуклеиновых кислот, фенолов или высоких концентраций ионов соли в образцах, которые могут вызывать интерференционное поглощение на 280 нм.
При обнаружении проб, содержащих примеси, фоновый фон может быть вычтен в сочетании с колориметрическим методом (например, методом BCA, методом Брэдфорда) или с использованием двойной длины волны (280 нм / 340 нм).
Техническое обслуживание приборов
Источники света: Избегайте длительной экспозиции и выключите источник света, когда он не используется, чтобы продлить жизнь.
Монохрометр: Периодическая замена осушителя (например, силикона) для предотвращения влаги и плесени дисперсионных элементов.
Детектор: предотвращает прямое попадание яркого света или накопление мокрой пыли, поддерживая чистоту.
Окружающая среда: прибор должен быть размещен на сухом, стабильном рабочем столе, вдали от вентиляционного отверстия кондиционера или прямого солнечного света, с контролем температуры 25°C ±2°C.
Специальная обработка проб
Образцы конденсации: медленно загружаются наклонными стенками на 45 градусов, чтобы предотвратить разливы или помехи кольца Ньютона.
Полисахариды: После обнаружения необходимо промыть жидкий путь реактивом этанола, чтобы избежать остатков.
Образец жира: в случае всплытия, сначала криогенное центробежное разделение, а затем обнаружение.
Сценарии применения и преимущества
Быстрая количественная оценка: без сложной предварительной обработки, завершение тестирования в течение 2 - 5 минут, подходит для скрининга высокого потока.
Микроскопическое тестирование: требуется всего 0,5 - 2 мкл образца, чтобы сэкономить ценные образцы (например, клинические образцы, редкие белки).
Многопараметрический анализ: некоторые приборы поддерживают одновременное обнаружение A260 (нуклеиновые кислоты), A280 (белки) и OD600 (концентрация бактерий) для достижения многокомпонентной количественной оценки.
Портативность: компактный дизайн для полевых испытаний или мобильных лабораторий.