Стабильность белкаЭто ключевой фактор, влияющий на его функцию, складку и деградацию, и прямое измерение стабильности белка в живых клетках всегда было проблемой в экспериментальных исследованиях. Традиционные методы часто сложны в работе, занимают много времени и затрудняют получение количественных результатов в живых клетках. Биологические датчики, основанные на эндогенных пептидах (Intein), предлагают новые идеи для решения этой проблемы.
Принципы биодатчиков, содержащих пептиды
Внутренние пептиды представляют собой самосрезанные полипептидные последовательности, присутствующие в белках - хозяевах, которые могут быть удалены путем самокаталитической реакции сдвига белков и соединены с обоими концами экзотических пептидов для формирования зрелых белков. Благодаря своей точной перегруппировке пептидных связей, эндогенные пептиды широко используются в белковой инженерии. Содержащиеся в некоторых микроорганизмах пептиды также могут индуцировать стимулы окружающей среды, такие как металлы, тепло и окислительный стресс, в качестве сенсорных элементов, которые регулируют функцию белка. Основываясь на этом, исследователи разработали несколько систем отчетности, основанных на сдвиге, для скрининга ингибиторов сдвига или построения биодатчиков.
Применение биодатчиков, содержащих пептиды, для мониторинга стабильности белков
В 2025 году команда Кристофера У. Леннона (Christopher W. Lennon) из Университета штата Мори (США) разработала биодатчик на основе эндопептидов для мониторинга стабильности белков в живых клетках в реальном времени. Суть метода заключается в том, чтобы вставлять целевые белки внутрь содержащихся пептидов, а не непосредственно сливать их в отчетные белки, эффективно избегая вмешательства целевых белков в структуру и функцию сообщаемых белков. Восстановление функции гена резистентности аминокислотных гликозидов (KanR) путем пересадки, так что активность сдвига напрямую связана с выживанием клеток, облегчает оценку стабильности белка по кривой роста.
В частности, метод использует свойства спонтанного срезания, содержащего пептиды в определенных условиях, напрямую связывая стабильность целевого белка с эффективностью сдвига для достижения количественной оценки стабильности белка в организме. Когда целевой белок стабилен, эндогенные пептидные сдвиги эффективны, функция KanR восстанавливается, и клетки выживают в питательных средах, содержащих антибиотики; И наоборот, когда целевые белки нестабильны, имплантированные пептидные сдвиги неэффективны, функция KanR не может быть восстановлена, и клетки умирают. Наблюдая за выживаемостью клеток, можно косвенно оценить стабильность целевых белков.
Реализация анализа высокого потока
Этот метод обладает потенциалом для анализа высокого потока. Культивируя различные мутанты или клетки в различных условиях обработки в микропористой пластине, можно одновременно контролировать стабильность белка в нескольких образцах. Кроме того, в сочетании с автоматизированной системой обработки жидкостей и технологией секвенирования высокого потока можно дополнительно улучшить аналитический поток.
Перспективы применения
Биологические датчики, основанные на эндопатидах, имеют широкие перспективы применения в мониторинге стабильности белков:
Быстрая оценка влияния мутации на стабильность белка: путем вставки мутанта внутрь содержащего пептид можно быстро выявить ключевые мутации, влияющие на стабильность белка.
Скрининг лекарств: Мониторинг изменений стабильности белков после обработки лекарств позволяет оценить влияние лекарств на функцию белков и обеспечивает важную основу для разработки лекарств.
Оптимизация экспрессии белка партнера: Мониторинг влияния экспрессии белка партнера на стабильность целевого белка может оптимизировать условия экспрессии белка партнера и повысить эффективность производства рекомбинантного белка.
Скрининг мелких молекулярных соединений: путем выявления мелких молекулярных соединений, влияющих на стабильность белка или реакцию на сдвиг, можно изучить механизмы их действия и предложить соединения - кандидаты для разработки новых лекарств.
заключение
Биологические датчики, основанные на содержании пептидов в живых клеткахСтабильность белковМониторинг в реальном времени предлагает новую парадигму. Этот метод имеет преимущества простоты в эксплуатации, высокого потока, точной количественной оценки и имеет широкие перспективы применения в таких областях, как исследования стабильности белков, скрининг лекарств и производство рекомбинантных белков. По мере развития технологий ожидается, что биодатчики, основанные на эндопатидах, будут играть более важную роль в исследованиях в области наук о жизни и биомедицинской промышленности.