Эффект матрицы (matrix effect / matrix interference) означает, что другие вещества в образце могут влиять на способность обнаруживать целевые анализаторы и наиболее распространены в иммунологических тестах биологических образцов, таких как сыворотка крови, плазма крови, тканевая симметрия и т.д., поскольку многие компоненты в таких образцах, такие как углеводы, белки, фосфаты, метаболиты и т.д., мешают связыванию антител с их мишенями или подавляют или усиливают сигналы, влияя на точную количественную величину анализа [1].

В биологическом анализе клинических исследований интерференция матрицы является еще более серьезной проблемой, например, в сыворотке крови и плазме крови были обнаружены различные типы помех, обычно эндогенных веществ, таких как ревматоидные факторы, гетерофильные антитела (антитела, вырабатываемые против неопределенных антигенов, демонстрируют низкую сродство и слабую связь), человеческие антитела против животных (HAAA, антитела с высоким сродством, возникающие при контакте иммунной системы с антителами животных) и другие плазменные белки, такие как альбумин, лизоцим, фибриноген и т. Д. [2], которые напрямую влияют на чувствительность, специфичность и изменчивость обнаружения, что приводит к неточному анализу.

Самым основным методом уменьшения эффекта матрицы является разбавление образца, но при условии, что уровень содержимого анализа после разбавления остается в линейном диапазоне и что разбавление влияет на чувствительность обнаружения и поэтому не является общей стратегией. Оптимизация pH и ионной прочности буфера также помогает уменьшить неспецифические взаимодействия. Другие стратегии преодоления помех включают добавление веществ, которые связываются или конкурируют с мешающими молекулами, таких как пассивное удаление человеческих антител против крыс (HAMA) с помощью соответствующего животного сывороточного коктейля, использование ингибиторов гетерофильных антител, таких как гетерофильные блокирующие реагенты (HBR) и иммуноглобулины ингибиторы (IIR), или использование F (ab '2) или одноцепочечных фрагментов (scfv) без Fc в качестве реагентов для захвата / обнаружения [3], но большинство из этих методов являются трудоемкими и дорогостоящими и не являются полезными для исследований больших образцов.

Для иммунологических тестов, основанных на испытаниях на связывание рецепторов (ligand binding assay, LBA), сокращение времени инкубации или времени обнаружения контакта реагента с матрицей оказалось одним из эффективных средств преодоления эффекта матрицы [4].Gyrolab ® На компакт - дисках с микропотоком реализован режим адсорсинтного потока, который минимизирует время контакта реагента с матрицей и минимизирует помехи матрицы.Shannon D. Chilewski et al. из Bristol - Myers Squibb [5] Использование Gyrolab ® Платформа решает проблему помех матрицы в доклинических исследованиях ПК.

Этот случай был отмечен в PK - тестировании на PEG - антитела, которое привело к нарушению матрицы, вызванному человеческим антителом против животных (HAAA). На этапе обнаружения препарата метод обнаружения, используемый для поддержки исследований с увеличением дозы однократного введения (single ascending dose, SDA), основан на методе электрохимического люминесцентного обнаружения (ECL), с целевыми молекулами в качестве реагентов для захвата, с козьими анти - VK антителами в качестве реагентов для обнаружения, с 50 - кратным разбавлением образца и количественным нижним пределом LLOQ 80 нг / мл.

Но при переходе от этапа обнаружения к этапу разработки требуется более низкая чувствительность к обнаружению и одновременное сохранение или повышение точности и точности, а LLOQ метода обнаружения ECL 80ng / mL больше не подходит для поддержки следующего этапа исследования по трем причинам:

Команда разработчиков заинтересована в характеристиках полураспада препарата в более низких дозах, если следовать текущим методам тестирования, результаты будут

Желательно измерить концентрацию препарата в цикле, когда EC50 составляет 78 нг / мл;

В случае появления иммуногенности антитело может оказывать очищающее действие на препарат, снижая уровень препарата в цикле, поэтому предполагается, что этот метод тестирования будет еще более ограничен для дозы препарата в более низких дозах.

　Чтобы повысить чувствительность к обнаружению и расширить LLOQ до требуемых 30 нг / мл, команда изучила использование Gyrolab. ® Платформа и комбинация новых реагентов для быстрой разработки новых методов обнаружения в течение ограниченного времени.

Сначала в Gyrolab ® Комбинация реагентов для захвата и обнаружения была отобрана с использованием поликлональных антител козы в качестве реагента для захвата, а антимонорезистентность мыши к особому типу в качестве тестового реагента, эта комбинация показала наилучшую производительность, концентрация улавливающих антител составляла 100 мкг / мл, а обнаруженные антитела - 2500 нг / мл. Использование Gyrolab ® Bioaffy 200 CD (размер образца 200 нл) и стандартный Gyrolab ® Трехступенчатый метод (захват - анализ - обнаружение) для анализа, образец разбавлен MRD 2.

PBS - T в качестве разбавленного буфера (PBS + 1% BSA + 0,05% Tween - 20), образец разбавлен в 2 раза. За три дня было проведено шесть CD - тестов. Каждый компакт - диск состоит из стандартной кривой и четырех повторов образцов QC с шестью уровнями. Стандартный диапазон кривых составляет 30 - 2000 нг / мл, а якорная точка - 2500 нг / мл. Образцы QC были разбавлены в 125 раз в сыворотке крови 100% людей, а затем в 2 раза с помощью контрольного буфера, чтобы концентрация упала в пределах измеренного диапазона. В таблице 1 показано, что все результаты имеют хорошую точность и точность обнаружения.

Параллельное сравнение проводилось с использованием буфера PBS - T и разбавленных образцов запатентованного Gyros буфера Rexxip H (Gyros). Поскольку метод обнаружения содержит монорезистентность мышей, человеческое антикрысиное антитело HAMA является потенциальным источником помех, а буфер Rexxip H содержит компоненты, нейтрализующие гетеросексуальные антитела, поэтому использование Rexxip H для разбавления должно подавлять сигналы помех матрицы.

Двадцать образцов сыворотки (10 образцов сыворотки NHS1 - 10 у нормальных людей и DPS1 - 10 у 10 больных людей) были проанализированы с использованием препарата в концентрации LLOQ 30 нг / мл, и все 20 образцов также были подвергнуты нестандартному анализу. Критерии приемки: 80% маркированных образцов подлежат рекуперации в пределах отклонения от номинальной концентрации ±25%, а все немаркированные образцы должны быть рекуперированы ниже LLOQ. Результаты (таблица 2) показывают, что нормальные образцы сыворотки человека, разбавленные с использованием буфера Rexxip H, соответствуют целевым критериям приема. Нормальный образец сыворотки человека № 2 с коэффициентом извлечения 252,6% с использованием PBS - T и коэффициентом извлечения в пределах 25% с использованием Rexxip H показывает, что буфер Rexxip H очень хорошо устраняет основные помехи в образце. В двух из образцов сыворотки сыворотки крови болезни, даже если они использовали буфер Rexxip H, обратная концентрация составляла 32 - 35 нг / мл. Поэтому при проектировании исследования людей с заболеваниями необходимо повторить маркировочные эксперименты, чтобы LLOQ был спроектирован как 40 нг / мл.

Резюме:

Перенос метода обнаружения электрохимической люминесценции (ECL) (LLOQ 80ng / mL) на Gyrolab ® На платформе, используя оптимизированные пары антител и буфер, были получены более чувствительные результаты тестирования, улучшенные LLOQ до 30 нг / мл, чтобы соответствовать требованиям будущих исследований.

Gyrolab ® Режим аффинитного протока платформы и запатентованный буфер Rexxip могут минимизировать снижение точности и чувствительности данных, вызванное эффектом матрицы.

Чтобы узнать о других случаях, когда Gyrolab снижает эффект матрицы, пожалуйста, свяжитесь с нами, прочитав оригинал.

Ссылки:

[1]. Селби К. Вмешательство в иммуноанализ. Энн Клин. Биохим. 36(Pt 6), 704-721 (1999).

[2]. Ана И. Барбоса, Нуно М. Рейс. Поверхностное покрытие антител приводит к вмешательству матрицы в микрожидкостных капиллярных иммуноанализах. Датчики ACS 2021 6 (7), 2682-2690.

[3]. Уильямс К, Эриксон Р, Фишер С.К. Преодоление специфического для заболевания матричного эффекта в клиническом фармакокинетическом анализе с использованием технологии микрожидкостного иммуноанализа. Биоанализ, 9(16), 1207–1216 (2017).

[4]. Салумех К. Фишер. Технологии анализа связывания лигандов: соответствие правильного инструмента вашей биоаналитической задаче. https://www.bioanalysis-zone.com.

[5]. Шеннон Д. Чилевски. Решение матричных эффектов в анализах связывания лигандов с помощью новых реагентов и технологий. Биоанализ (2014) 6(8), 1059–1067.