Краткое описание системы выражения дрожжей Биччи

Система экспрессии Pichia pastoris, как эффективная система экспрессии истинного ядра, имеет широкий спектр применений и значительные преимущества. Преимущества системы экспрессии дрожжей Бичи очевидны по сравнению с другими системами экспрессии. Он имеет один из современных мощных и строго регулируемых инициаторов - инициатор гена оксидазы спирта AOX1, что делает регулирование экспрессии экзогенных генов более точным и эффективным. Его высокий уровень экспрессии, как для достижения внутриклеточной экспрессии, так и для секреционной экспрессии, в значительной степени отвечает потребностям различных исследований и производства. Процесс ферментации созрел и легко усиливается, уже обладает способностью к крупномасштабному промышленному производству с высокой плотностью, что обеспечивает благоприятные условия для развития индустриализации. Низкие затраты на культивирование, продукты легко отделяются, используемые ферментированные питательные среды дешевы и не содержат белков, что способствует разделению и очистке продуктов вниз по течению, снижает затраты на производство. Гены экзогенного белка генетически стабильны, интегрированы в дрожжевую хромосому Бичи, могут быть скопированы с хромосомой и стабильны, нелегко потерять. Кроме того, как эукариотическая экспрессивная система, Биччи дрожжи также имеют субклеточную структуру эукариотидов, которые могут трансформировать экспрессируемые белки, такие как гликирование, жирное ацилирование и фосфорилирование белков, так что экспрессируемые белки структурно и функционально ближе к природным белкам и имеют более высокую биологическую активность.

II. Состав системы выражения дрожжей Бичи

1. Бактерии - хозяева

В настоящее время для экспрессии экзогенных белков используются следующие бактерии - хозяева: Mut + метанол - содержащие GS115, X - 33, SMD1165, SMD1163 и SMD1168; Метанол MutS использует медленный KM71; Мут - метанол без использования MC100 - 3. Более подробная информация приведена в таблице ниже, в которой подробно перечислены различные экспрессивные бактерии и экспрессивные характеристики дрожжей Бичи

Таблица 1 Распространенные дрожжи биччи экспрессируют бактерии - хозяева и их характеристики

Штамм	особенность
ГС115	Высокий уровень экспрессии, высокая плотность клеток, высокое производство растворимого белка, в настоящее время широко используется бактерия - хозяин
КМ71	Метанол использует медленный тип, подходящий для экспрессии труднорастворимых белков
X33	Повышает экспрессию и активность, подходит для экспрессии рекомбинантных белков
SMD1168H	Более эффективная экспрессия и более высокая плотность клеток, подходящие для экспрессии больших молекулярных белков
SMD116 (хис4 пеп4)	Является дефицитным штаммом протеазы, который уменьшает разложение белка и решает проблему неравномерного распределения продуктов экспрессии, вызванных разложением белка, хотя штамм растет относительно медленно, что может привести к более низкой продуктивности экспрессированного экзогенного белка.
Y-11430	Эффективное выражение и регулируемое выражение.

2, носитель

носитель выражения дрожжей Бичи в основном интегрированный носитель, общий носитель можно разделить на внутриклеточный носитель выражения и секреционный носитель выражения.

Таблица 2 Распространенные концентраторы и характеристики дрожжей бичи

III. Процесс брожения биччи

1. стадия брожения биччи

Ферментирование дрожжей Биччи обычно состоит из двух этапов: 1, фаза роста клеток: сначала в среде, в которой источником углерода является глицерин или глюкоза, фаза роста, которая накапливает достаточную плотность клеток и биомассу, при достижении определенной стадии концентрации бактерии, когда глицерин или глюкоза истощаются, приводит к внезапному повышению растворенного кислорода примерно до 100%, затем начинается поток глицерина или раствора глюкозы, а также поддерживается вентиляция и скорость перемешивания, чтобы поддерживать уровень растворенного кислорода около 30%, а дальнейший рост биомассы (концентрация бактерий). 2, индукционная фаза: когда биомасса соответствует требованиям, остановить пополнение источника углерода, истощение источника углерода, после переходного периода переключить источник углерода на метанол для индукции экспрессии фазы ферментации целевого белка. Обычно с перерывами добавляется 0,3% метанола дважды, а затем начинается метанол, индуцирующий экспрессивный белок, который повышает экспрессию экзогенного белка и позволяет дрожжам Бичи накапливать высокие концентрации целевого белка за относительно короткий промежуток времени.

Этап индуцированной экспрессии является ключевым звеном в процессе ферментации дрожжей Бичи, на котором метанол используется в качестве специфичного индуктора вместо предыдущего источника углерода. Гены оксидазы спирта (например, AOX1) в дрожжах Бичи активируются в присутствии метанола, что приводит к эффективной экспрессии экзогенных генов. Контроль условий на этом этапе оказывает значительное влияние на производство и качество экзогенных белков и требует строгого контроля таких параметров, как количество добавок метанола, скорость добавления и температура, pH и растворимость кислорода в ферментационной среде, чтобы обеспечить устойчивое и эффективное экспрессирование экзогенных генов, избегая при этом токсичности метанола для клеток и других неблагоприятных последствий.

Виды и формулы ферментированных сред

Различные виды сред для ферментации дрожжей Бичи разнообразны, и различные формулы сред подходят для различных стадий и целей ферментации.

Среда BSM (основная соль) является одной из основных питательных сред, обычно используемых для брожения дрожжей Бичи, типичная формула которой: 85% фосфата 26,7 мл / л, дигидросульфат кальция 0,93 г / л, сульфат калия 18,2 г / л, семиводный сульфат магния 14,9 г / л, гидроксид калия 4,13 г / л, глицерин 40,0 г / л, PTM1 4.35 мл / л. Эта среда обеспечивает основные питательные вещества для роста дрожжей Бичи, включая неорганические соли, такие как азот, фосфор, калий, магний и глицерин в качестве источника углерода, а PTM1 дополняет питательные вещества, такие как микроэлементы и витамины, необходимые для роста дрожжей, помогая поддерживать нормальный рост и метаболизм дрожжевых клеток.

Среда F22 также является распространенной средой ферментации дрожжей Бичи, состав которой может быть скорректирован в различных исследовательских и производственных целях, но обычно содержит умеренные количества источников углерода (например, глюкозы или глицерина), азота (например, дрожжевые экстракты, пептон и т.д.), неорганических солей (таких как сульфат магния, хлорид кальция, фосфат дигидрокалия и т.д.) и других добавок (например, биотина, растворов микроэлементов и т.д.). По сравнению с средами BSM питательные среды F22 могут быть оптимизированы с точки зрения состава и соотношения питательных веществ для удовлетворения конкретных потребностей в ферментации, таких как улучшение экспрессии экзогенных белков или улучшение качества белков в некоторых случаях.

В дополнение к двум распространенным средам, описанным выше, существует много других сред для брожения дрожжей бичи, состав которых часто оптимизирован и скорректирован с учетом конкретных экспериментальных целей, свойств штаммов и требований процесса ферментации. Например, в некоторых исследованиях для повышения эффективности использования дрожжей Биччи в конкретных субстратах или повышения их толерантности к воздействию окружающей среды в питательную среду добавляются специальные компоненты, такие как аминокислоты, органические кислоты, полисахариды и т.д.; Или оптимизировать пути роста и метаболизма дрожжевых клеток путем корректировки соотношения источников углерода, азота и неорганических солей в питательной среде для достижения более высокой эффективности ферментации и производства продуктов.

3. Параметры процесса ферментации

В процессе ферментации дрожжей Биччи точный контроль технологических параметров играет решающую роль в успехе ферментации, эти параметры включают pH, температуру, растворенный кислород и т. Д. Они взаимосвязаны и взаимодействуют друг с другом, чтобы определить состояние роста дрожжей Биччи, метаболическую активность и уровень экспрессии экзогенного белка.

pH - один из ключевых факторов, влияющих на брожение дрожжей бичи. Дрожжи Бичи имеют разные требования к pH на разных стадиях роста и метаболических процессах. На стадии клеточного роста обычно подходящий диапазон pH составляет 5,0 - 6,0, при этом pH дрожжевые клетки могут поддерживать хорошее состояние роста, активность ферментов также может быть лучше задействована, что способствует размножению клеток и накоплению метаболитов. Уровень pH в процессе ферментации дрожжей Бичи влияет не только на состояние роста бактерий, но и на экспрессию экзогенных белков. Влияние pH на дрожжи Биччи в основном включает в себя следующие аспекты: (1) влияет на активность внутриклеточных ферментов, что, в свою очередь, влияет на метаболизм клеток, что также влияет на экспрессию экзогенных белков; (2) влияет на проницаемость клеточной мембраны, оказывает определенное влияние на клетки при поглощении питательных веществ и выведении метаболитов; (3) pH влияет на диссоциацию компонентов и метаболитов клеток в питательной среде, что влияет на поглощение питательных веществ клетками; (4) Значение pH также может влиять на метаболические процессы в клетках, изменяя содержание метаболитов в клетках. Кроме того, в процессе ферментации высокой плотности, чтобы уменьшить разложение экзогенных белков протеазами, следует избегать оптимального значения pH протеазы и устанавливать значение pH в электрических точках, таких как отклонение от экзогенных белков, а также повышать урожайность экзогенных белков.

Температура: также оказывает значительное влияние на рост и метаболизм дрожжей бичи. Температура роста дрожжей Бичи, как правило, более подходящая от 28 до 30 °C. В этом температурном диапазоне дрожжевые клетки растут быстрее и метаболически активны, что позволяет эффективно использовать питательные вещества в питательных средах для роста и размножения. Однако, если температура слишком высока и превышает 32°C, это может привести к гибели клеток, поскольку высокая температура нарушает стабильность мембранных структур клеток, биологических макромолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты, что влияет на нормальную физиологическую функцию клеток. Напротив, при более низких температурах, хотя рост клеток замедляется, некоторые исследования показывают, что правильное снижение температуры культивирования может улучшить производство и качество белка - мишени. Это связано с тем, что низкая температура может снизить напряжение сворачивания белка в клетке, уменьшить возникновение неправильного сворачивания, а также уменьшить активность протеазы и снизить гидролиз экзогенных белков, что способствует правильному сворачиванию и накоплению экзогенных белков.

Растворимый кислород (DO) - еще один ключевой технологический параметр в процессе брожения дрожжей Бичи. Дрожжи Бичи нуждаются в участии кислорода при выращивании и метаболизме глицерином и метанолом, поэтому поддержание надлежащего уровня растворения кислорода имеет решающее значение для обеспечения бесперебойной ферментации. На протяжении всего процесса ферментации концентрация растворенного кислорода обычно должна поддерживаться на уровне > 20%. На ранних стадиях роста клеток потребность в кислороде относительно низка из - за небольшого количества бактерий, и в это время потребность клеток в растворенном кислороде может быть удовлетворена путем надлежащей вентиляции и перемешивания. По мере роста клеток и усиления метаболической активности потребление кислорода постепенно увеличивается, и в это время необходимо дополнительно скорректировать объем вентиляции, скорость перемешивания или повысить уровень растворения кислорода с помощью добавок чистого кислорода, чтобы гарантировать, что клетки получают достаточное количество кислорода для метаболизма. При недостаточном растворении кислорода это может привести к медленному росту клеток, снижению накопления метаболитов и даже к гибели клеток, что серьезно повлияет на эффективность ферментации и производство продуктов.

Время культивирования: это один из наиболее важных факторов для достижения самого высокого уровня экспрессии белка в системе экспрессии дрожжей Бичи, где время производства относительно велико (около 100 ч). Время культивирования связано с количеством дрожжевых клеток и степенью разложения целевого белка, некоторые исследования показывают, что максимальная плотность роста дрожжевых клеток Пастера Биччи составляет 96 ч, в то время как самая высокая экспрессия белка происходит в 48 ч [11], что указывает на то, что более длительное время культивирования, вероятно, приведет к гидролизу выраженного белка, а другие исследования показывают, что оптимальное время экспрессии белка происходит при культивировании 72 ~ 96 ч [2]

Процесс ферментации дрожжей Бичи является сложным и тонким процессом, требующим точного контроля и оптимизации фазы ферментации, формулы питательной среды и технологических параметров. Условия ферментации, такие как pH, температура, растворимый кислород и состав питательной среды, могут быть систематически оптимизированы методом экспериментального проектирования (DOE), чтобы в полной мере использовать преимущества дрожжей Бичи для достижения эффективного выражения и производства экзогенных белков. Благодаря глубокому пониманию характеристик и потребностей ферментации дрожжей Бичи, в сочетании с передовыми методами ферментации и оборудованием, постоянно оптимизировать процесс ферментации, ожидается, что эффективность ферментации дрожжей Бичи и качество продукта будут еще более улучшены.

IV. "молчаливое сотрудничество" дрожжей Бичи с ферментером

В процессе ферментации дрожжей Бичи ферментатор, как основное оборудование, обеспечивает критические условия окружающей среды для роста и метаболизма дрожжей Бичи, гарантируя, что они могут эффективно выражать экзогенные белки.

Ферментеры обеспечивают надлежащую температуру роста дрожжей Бичи с помощью точной системы контроля температуры. Как упоминалось ранее, на стадии роста дрожжей Биччи при температуре 28 - 30°C, а также при специфических требованиях к температуре во время индуцированной экспрессии, система терморегулирования ферментатора может точно поддерживаться в этих заданных температурных диапазонах, избегая неблагоприятных последствий высоких или слишком низких температур для роста дрожжевых клеток и экспрессии белков. Этот точный контроль температуры особенно важен в крупномасштабном ферментационном производстве, которое гарантирует, что каждая партия дрожжей Биччи будет расти в стабильной и подходящей температурной среде, тем самым повышая стабильность и повторяемость производства.

Для регулирования pH ферментер оснащен усовершенствованным устройством обнаружения и регулирования pH. На разных стадиях брожения дрожжей Бичи, в зависимости от изменения их потребности в pH, ферментер может автоматически добавлять кислотно - щелочной раствор, который точно поддерживает pH в требуемом диапазоне. Поддержание pH 5.0 - 6.0 на стадии роста клеток, индуцированная фаза экспрессии настраивается до 3.0 - 5.0, и этот точный контроль pH помогает поддерживать активность ферментов в дрожжевых клетках, способствует нормальному росту и метаболизму клеток, уменьшая при этом деградацию экзогенных белков и улучшая производство и качество белков.

Контроль уровня растворенного кислорода также является одной из ключевых функций ферментатора. Дрожжи Бичи имеют более высокий спрос на растворенный кислород во время ферментации, и ферментор обеспечивает, чтобы концентрация растворенного кислорода оставалась на уровне > 20% с помощью разумной системы вентиляции и устройства перемешивания. Система вентиляции может равномерно вводить воздух или кислород в ферментер, в то время как устройство перемешивания путем постоянного перемешивания, так что кислород полностью рассеивается в ферментере, повышает эффективность передачи кислорода, удовлетворяет потребности дрожжей Бичи в кислороде на разных этапах роста, обеспечивает нормальную метаболическую активность, тем самым способствуя эффективному выражению экзогенных белков.

Синергия систем перемешивания и вентиляции также обеспечивает равномерное распределение питательных веществ в ферментере, избегая локального дефицита или избытка питательных веществ и позволяя каждой дрожжевой клетке Биччи расти в хорошей питательной среде. В то же время герметичность ферментера также важна для предотвращения загрязнения внешними бактериями, обеспечения чистоты и стабильности процесса ферментации дрожжей Бичи и предотвращения таких проблем, как провал ферментации или снижение качества продукта из - за заражения бактериями.

Продукция ферментатора Jinweisheng основана на этих ключевых потребностях для проектирования и производства, Имея усовершенствованный контроль температуры, регулирование pH, управление растворением кислорода и эффективную систему перемешивания и вентиляции, Он может обеспечить оптимизированные условия окружающей среды для ферментации дрожжей Bichi, чтобы помочь пользователям реализовать эффективное и стабильное производство брожения дрожжей Bichi, будь то на этапе лабораторных испытаний или в крупномасштабном промышленном производстве, может играть производительность, удовлетворять различные потребности различных пользователей в брожении дрожжей Bichi и способствовать бурному развитию биотехнологической промышленности. Мы будем продолжать уделять внимание исследовательской динамике и прикладным потребностям дрожжей Bichi, постоянно оптимизировать и внедрять инновационные технологии проектирования и производства ферментеров, повышать производительность и стабильность ферментеров, обеспечивать более совершенную и эффективную поддержку оборудования для ферментационного производства дрожжей Bichi, совместно продвигать биотехнологическую промышленность к более блестящему будущему.

Презентация ферментера.
Jimway-be ® Серия Lab - - настольные реакторы

Jimway-be ® Серия PM - - мультиплексные биореакторы

Сфера применения: культивирование и ферментация и экспрессия протоядерных / эукариотических клеток

Объем чашки Петри: 250 мл / 500 мл / 1L / 3L / 5L / 10L

Количество модулей: 2 - 16 соединений

Способ культивирования: суспензия и наклейка стенок

Тип лопасти: три наклонных лопасти, шесть наклонных лопастей, шесть плоских лопастей, полутрубчатый тип, подъемное весло и другие комбинации

Способ передачи: привод с магнитной связью / механическое перемешивание

Стратегия управления: PID & ступенчатая стратегия управления (добавка, скорость перемешивания, температура, вентиляция и т.д.)

Управление добавкой: точное управление добавкой (ошибка ±1g)

Функциональные характеристики:

Интерфейс прост: несколько минут, чтобы овладеть операцией, с меньшим успехом

Без дежурства: можно получить удаленный доступ, управлять, реализовать беспилотное дежурство

Функция формулы: формула выпускается одним нажатием клавиши, уменьшает ошибки в работе персонала, улучшает качество

Анализ данных: реализация многопартийного сравнения данных, также может быть подключена к Doe & PAT для достижения глубокого многовариантного анализа, оптимизации технологических данных

Обмен данными: веб - релиз на основе VPN, обеспечивающий мониторинг и просмотр исторических кривых на мобильных устройствах (Android, IOS, Windows) с гарантией безопасности данных и устройств