В системе обнаружения анализаторов аминокислот постцилиндрические производные являются ключевым шагом в преобразовании разделенных хроматографических колонн аминокислот в производные, которые могут быть обнаружены с высокой чувствительностью, а флуоресцентное обнаружение является основным средством количественного анализа аминокислот путем захвата флуоресцентных сигналов производных. Сочетание этих двух может решить проблему « слабого флуоресцентного сигнала самой свободной аминокислоты и трудного прямого высокочувствительного обнаружения», является основной технической комбинацией современного анализа аминокислот (особенно микроанализа), принцип которого может быть разобран на « механизм реакции после колонны» и « оптический принцип флуоресцентного детектирования», как указано ниже:
I. Принцип постколонного производного: преобразование "труднообнаруживаемых аминокислот" в "легко обнаруживаемые производные"
Молекулы аминокислот (за исключением триптофана) сами по себе не имеют сильной ультрафиолетовой абсорбции или флуоресцентных излучающих групп, а чувствительность при непосредственном обнаружении крайне низка (не отвечает требованиям микроанализа уровня мкг / Л). Основная логика, полученная после колонны, заключается в том, что аминокислоты, отделенные ионообменной хроматографической колонкой (обычно используемый режим разделения для анализа аминокислот), химически реагируют с конкретным « производным реагентом» после выхода колонны, создавая стабильные производные с сильной флуоресценцией (или сильным ультрафиолетовым поглощением), создавая условия для последующего высокочувствительного обнаружения.
1.Основной процесс: разделение → смешивание → реакция → обнаружение
Постколонная производная система состоит из « резервуара для хранения производных реагентов, смесителя, реакционного змеевика, термостата », конкретные шаги:
Разделение аминокислот: различные аминокислоты в образце отделяются ионно - обменными колоннами (например, катионообменными смолами на основе сульфата) и вытекают из колонн в определенном порядке из - за различий в сродстве между различными аминокислотами и смолами;
Смешивание реагентов: после разделения поток аминокислот (проточная фаза + аминокислота) полностью смешивается с потоком производных реагентов (например, трикодон, фталат OPA, 9 - метилхлорат FMOC) через « Т - образный смесь»;
Реакция при постоянной температуре: смесь поступает в "змеевик термореактивных реакций" (обычно 30 - 130°C, в зависимости от реагента), производные реакции происходят при определенной температуре, образуя производные флуоресценции;
Вход в детектор: производные после реакции поступают непосредственно в флуоресцентный детектор для захвата сигнала.
Принцип флуоресцентного обнаружения: улавливание флуоресцентных сигналов производных, достижение количественного анализа
Флуоресцентное обнаружение основано на феномене « фотолюминесценции»: когда производные флуоресценции облучаются светом (лазерным светом) на определенной длине волны, поглощаемая электронами энергия в молекуле переходит на высокий энергетический уровень, а затем часть энергии высвобождается через нерадиодный переход, который затем переходит обратно в основное состояние и излучает свет (флуоресценцию) на определенной длине волны. Флуоресцентный детектор преобразует интенсивность флуоресценции в электрический сигнал посредством « возбуждающей световой фильтрации, сбора флуоресценции, преобразования сигнала», в конечном итоге для достижения количественного анализа аминокислот.
Основная структура и рабочий процесс флуоресцентных детекторов
Флуоресцентный детектор состоит в основном из « источника света, возбуждающего монохроматора, пула образцов, эмиссионного монохроматика, фотоумножителя (PMT), сигнального процессора», конкретные шаги заключаются в следующем:
генерация возбужденного света: комбинированный свет, излучаемый источником света (часто используемые ксеноновые лампы, которые обеспечивают непрерывный спектр 200 - 800 нм), отфильтрован « возбуждающим монохроматом» (состоящим из растра и щелей) и сохраняет только монохроматический свет, соответствующий производной « длине волны» возбуждения (например, производная OPA соответствует лазерному излучению 340 нм);
флуоресцентное возбуждение и эмиссия: возбуждающий свет проходит через пул образцов (протекает через производный раствор, полученный после колонны), производные молекулы поглощают энергию и излучают флуоресценцию (направление флуоресценции перпендикулярно возбужденному свету, избегая возмущений возбуждающим светом);
Флуоресцентная фильтрация и сбор: излучаемая флуоресценция фильтруется « эмиссионным монохроматором» (удаляет рассеянный свет и неуправляемое возбуждающее свечение), сохраняя только монохроматический свет, соответствующий производной « длине излучаемой волны» (например, производная OPA соответствует излучающему свету 450 нм);
Преобразование и количественное измерение сигнала: после фильтрации флуоресценция принимается « фотоэлектронным умножителем (PMT) », PMT преобразует слабый световой сигнал в пропорциональный электрический сигнал (ток или напряжение), а затем усиливается процессором сигнала, модульное преобразование, генерирует хроматографию « интенсивность флуоресценции - зарезервированное время»;
Количественная основа: на основе « удлиненной формы флуоресценции закона Ламбера - Билла» - интенсивность флуоресценции производных флуоресценции пропорциональна концентрации аминокислот в определенном диапазоне концентраций, и концентрация каждой аминокислоты в образце может быть рассчитана путем сравнения « интенсивности флуоресценции (стандартной кривой) производных стандартных аминокислот» и « интенсивности флуоресценции производных образца».
Основные преимущества флуоресцентного тестирования: высокая чувствительность и высокая специфичность
По сравнению с ультрафиолетовой абсорбцией, флуоресцентное тестирование имеет незаменимые преимущества в анализе аминокислот, что также является основной причиной, по которой послеколонные производные часто используются в сочетании с флуоресцентным обнаружением:
Высокая чувствительность: предел обнаружения флуоресцентного теста (LOD) может достигать уровня nmol / L или даже pmol / L (на 1 - 3 порядка ниже, чем ультрафиолетовый тест) и может обнаруживать следы аминокислот в биологических образцах (например, в крови, моче) (например, увеличение микроаминокислот, вызванное метаболическими аномалиями);
Высокая специфичность: может обнаруживать только « производные, способные генерировать флуоресценцию», в то время как проточная фаза, примеси (если они не реагируют с производными реагентами) практически не имеют флуоресцентных сигналов, эффективно избегая помех при гетеропике (например, анализ аминокислот после гидролиза белков в продуктах питания, без сложной предварительной обработки и дезактивации);
Широкий линейный диапазон: интенсивность флуоресценции имеет хорошую линейную зависимость от концентрации аминокислот в диапазоне концентраций 10⁴–10⁵ и подходит для количественной оценки проб с различным содержанием (от микро до констант).
III. Синергетическая логика постстолбцового производного и флуоресцентного обнаружения (почему это должно сочетаться?)
Сочетание этих двух идеально решает « разделение - обнаружение» болевых точек для обнаружения аминокислот, образуя замкнутое кольцо:
После разделения производные, избегая помех: после колонны производные аминокислоты после разделения хроматографической колонны, производные реагенты не реагируют с примесями в образце (например, белки, соли) (примеси были отделены хроматографической колонной или не имеют аминокислот), избегая « разделения влияния производных примеся» (предколонные производные могут перекрываться пиками из - за совместного смывания производных и примесей);
Производная флуоресценция, повышение чувствительности: путем производного преобразования « безрлюминесцентных аминокислот » в « сильные флуоресцентные производные», так что флуоресцентное тестирование может захватывать слабые сигналы для удовлетворения потребностей в анализе следов (например, точное обнаружение метаболического спектра аминокислот в клинической диагностике);
Сигнал привязан к концентрации для достижения количественной оценки: интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации производных (т. е. концентрации первичной аминокислоты), в сочетании со стандартной кривой можно точно количественно определить содержание каждой аминокислоты, результат хорошо повторяется (RSD обычно < 2%).