Оценка количества EV, определение наличия EV и оценка доли и влияния компонентов EV в Центральной Африке при подготовке EV требуют представления EV. Изображения EV сталкиваются с проблемами малого размера частиц, разнородности размеров и молекулярной неоднородности, отсутствия универсального метода распознавания EV и неEV - специфичности многих методов измерения.Ни одно из измерений или методов не отвечает требованиям всех представлений EV, поэтому рекомендуется проверять друг друга ортогональным методом (т. е. методом без одинаковых ограничений измерения).Это означает, что параметры EV, как ключевой атрибут качества (CQA), рекомендуются для обнаружения одного и того же показателя с использованием двух или более различных принципов.
Общий состав EV (содержание и пропорции белков, липидов, нуклеиновых кислот и других биологических молекул и т.д.) варьируется в зависимости от источника EV. Хотя измерения этих отдельных молекулярных классов могут быть использованы для оценки плотности EV, эти значения не обязательно полностью связаны с концентрацией EV и не являются универсальными между исходными материалами; Поэтому,Они не должны использоваться в качестве показателя концентрации EV.Подобно тому, как ни один молекулярный тест не может количественно оценить все EV, нет универсального молекулярного маркера для подтипов EV или EV. Конкретные маркеры должны отбираться на основе доказательств происхождения и типологии. В настоящее время,Пока нет известных универсальных маркеров, которые могли бы идентифицировать все EV, независимо от их происхождения.Для так называемых экзосом универсальность этих маркеров неясна или не принята. Обратите внимание, что схемы, основанные на сродстве с участием четырехкратных трансмембранных белков CD9, CD63 и CD81, не являются специфическими для экзосом, который является подтипом EV; Использование группы EV, обогащенной антителами к одному из этих четырех трансмембранных белков, не может не полностью охватить весь молекулярный состав. Кроме того, не все EVs экспрессируют эти белковые маркеры, поэтому четырехкратное обогащение трансмембранных белков не захватывает все EVs.Метод определения ортогональных параметров(Метод более чем одного принципа)Вряд ли будет такое же отклонение; Например, диаметр EV выводится и обнаруживается оптическими и неоптическими методами соответственно.Использование ортогональных методов для представления образцов ЭВ также имеет решающее значение для доказательства того, что конгенеры не связаны с биомаркерами или функциональными открытиями.Поскольку многие методы представления EV не являются специфическими для EV или не могут обнаружить все EV, методы и результаты должны быть прозрачными для обеспечения воспроизводимости данных EV.
Количественная оценка концентрации частиц
Количественные и объемные измерения EV в совокупности определяют числовую концентрацию (в единицах particles / mL), показатель, который широко освещается и используется. Тем не менее, он часто ненадежный, потому что многие технологии не имеют специфичности для EV и чувствительности ко всем EV.Рабочая группа ISEV по строгим и стандартизированным EV - справочным материалам недавно изложила соображения, связанные с методами измерения, а также проблемы, с которыми сталкивается эта область при работе с EV - справочными материалами, которые отслеживаются, разрабатываются и сообщают о хороших характеристиках. Ключевым моментом в этой работе является необходимость опубликования LOD метода тестирования, который позволяет другим проверять результаты, независимо от ограничений чувствительности.Использование ортогональных методов может повысить достоверность измерений концентрации EV，Каждый метод имеет определенный LOD, например, для определения интенсивности рассеяния света.(Как NTA)Интенсивность флуоресценции(Например, FCM)& Физический размер(Например, RPS),Потому что ортогональные методы не имеют одинаковых ограничений измерения.. Например, метод индукции импульсов сопротивления (RPS) может быть использован для представления LOD диаметром частиц. Для оптических методов, таких как проточная цитология, LOD может быть сообщен с помощью молекул диаметра, полученных из оптических моделей рассеяния света, или эквивалентных растворимых флуоресцентных скоплений (MESF), полученных из интенсивности флуоресценции. Эти методы могут генерировать последовательные данные между различными приборами и чувствительностью. Поскольку обнаружение частиц связано с большим количеством переменных,В настоящее время нет методов для анализа отслеживания наночастиц (NTA), динамического рассеяния света (DLS))Или визуализация проточной клеточной хирургии, чтобы отследить LOD.А.Для технологий, которые не могут отличить EV от других потенциальных конгенеров или загрязнителей, независимо от стадии разделения вверх по течению, рекомендуется сообщать о концентрации как « концентрация частиц или концентрация EP», а не как « концентрация EV».
II. Количественная величина частиц
Измерения размера EV (в нанометровом радиусе или диаметре) зависят от предположений, таких как сферическая форма или скорость миграции, и на результаты могут влиять переменные вверх по течению. Обычные высокопроизводительные методы, включая проточную цитологию, NTA、RPS、 Многоугольное рассеяние света и динамическое рассеяние света (DLS) предполагают, что EV имеет сферическую форму. Хотя « размеры» и « диаметры» часто взаимодействуют между методами измерения, способ их вывода также может привести к последовательным различиям между методами измерения. Например,Технологии, основанные на броуновском движении частиц (например, NTA или DLS), измеряют гидродинамический диаметр, что приводит к завышению размера частиц по сравнению с методами визуализации, такими как криогенные зеркала.Существует очень мало способов точного измерения размеров EV во всем диапазоне возможных диаметров EV (от нескольких десятков нанометров до микрон). Например, в то время как визуализация с высоким разрешением для криогенных зеркал является одним из самых точных методов, поток обнаружения относительно низок, и многие более крупные EV, как правило, имеют меньшее количество и могут не быть количественно определены. Способность измерять низкоконтрастные EV ниже 100 нм также может быть ограничивающим фактором.
По мере того, как все больше и больше исследователей используют более чувствительные специализированные методы анализа одиночных частиц, становится все более очевидным, что многие препараты EV демонстрируют асимметричное распределение справа, например, логарифмическое нормальное распределение, большинство из которых имеют диаметр EV < 100 нм. Большинство методов анализа одиночных частиц не могут анализировать все группы EV, поэтомуИсследователи должны делиться обнаруженным распределением EV по диаметру.，Вместо агрегированных показателей, таких как средний размер, размер концентрации или средний размерЭти показатели легко наклоняются из - за LOD и асимметричного распределения размеров. Пожалуйста, обратите внимание,Статистические данные о размерах, такие как измерения частиц с низкой скоростью преломления с помощью NTA, могут быть ближе к реальному модальному диаметру группы EV, чем LOD прибора.Использование программного обеспечения с проприетарными алгоритмами для определения размера частиц также может привести к различиям между версиями программного обеспечения или программными платформами, поэтому программное обеспечение и его версии также должны быть доступны.Метод выведения размера из предположения о коэффициенте преломления может изменяться в зависимости от состава выборки и содержимого.Размер, полученный с помощью флуоресцентных зондов (например, мембранных встроенных красителей), может меняться в результате внедрения различных красителей на основе различных компонентов мембранного жира. Для технологий, которые не могут отличить EV от COV / загрязнителей, независимо от стадии разделения вверх по течению, рекомендуется представлять отчеты о диаметре как "частицы" или "EP" диаметр, а не "EV диаметр".
III. ПРИМЕЧАНИЯ К ОТЧЕТНЫМ ТЕХНИЧЕСКИМ ОТЧЕТАМ
По мере того, как эксперименты и приборы для обнаружения EV используются и расширяются экспертные знания, определение соответствующих показателей отчетности также растет, чтобы обеспечить надежность и воспроизводимость данных. В руководстве MISEV2023 содержится подробный список мер предосторожности для минимальных экспериментов и конкретных отчетов по приборам. Они обычно применяются независимо от экспериментального дизайна. Перечисленные здесь технологии не являются исчерпывающими, и многие методы обнаружения разрабатываются или активно изучаются. Тем не менее, все перечисленные технологии являются коммерчески доступными и имеют публикации от нескольких исследователей. (Из - за ограничений по объему, здесь я перечислил только описание нескольких используемых в настоящее время инструментов для определения размера частиц и концентрации EV и их основные взгляды)[Поточная цитология на основе микрошариков]ISEV рекомендует, чтобы контрольная группа включала гомотипические антитела, используемые для обнаружения антител, или гомотипические сцепленные микрошарики, а также захваченные микрошарики, содержащие только обнаруженные антитела (для захвата шариков, используемых для взятия пакетов антител); Для демонстрации титрования сигнала следует использовать несколько концентраций EV; Если микрошарики приготовлены, их реактивы и химический состав должны быть объявлены; Следует также публиковать каталоги и номера партий реагентов для коммерческого улавливания микрошариков; Публикация средних значений интенсивности флуоресценции для стандартизированных микрошариков; Публикация данных о молекулах эквивалентных растворимых флуоресцентных скоплений (MESF) и средних значениях флуоресцентной интенсивности (как и в случае с однократной эВ - проточной цитологией); Следует опубликовать полную и подробную методологию.ОдноэВ - проточная цитологияВ 2023 году по инициативе Рабочей группы трех обществ (Рабочая группа по проточной клеточной хирургии EV), в состав которой входят Международное общество внеклеточных пузырьков (ISEV), Международное общество по прогрессированию клеточного счета и Международное общество тромбоза и гемостаза, был опубликован План одноклеточной проточной клеточной хирургии, в котором всесторонне рассматриваются меры предосторожности при разработке одноклеточных проточных клеточных тестов.Калибровка параметров объема образца, флуоресценции и рассеяния света имеет решающее значение для интерпретации и копирования результатов с одним потоком EV. Если концентрация частиц сообщается с помощью однократного EV - проточного цитометра, установите верхний и нижний пределы LOD, чтобы позволить использовать ортогональные методы или других людей для повторения и проверки результатов.В настоящее время в визуализационном цитометре используется динамический триггерный метод, который затрудняет определение более низкого LOD и, следовательно, стандартизацию.[Динамическое рассеяние света]DLS， Также известный как спектр фотонной корреляции (PCS) и квазиупругое рассеяние света (QELS), это технология, которая может определить гидродинамический диаметр достаточно монодисперсных частиц в дисперсии разбавленного водного раствора. DLS измеряет корреляционную функцию интенсивности лазера, рассеянного несколькими частицами в растворе. Автокорреляционная функция несет информацию о коэффициентах диффузии частиц, связанных с гидродинамическими диаметрами через теорию движения Стокса - Эйнштейна Брауна.Коэффициент диффузии может быть выведен из измеренной корреляционной функции с помощью нескольких алгоритмов. Наиболее распространенным методом является кумулятивный анализ, ноОн предполагает, что образцы представляют собой монодисперсное распределение по размерам, а образцы EV не имеют такого распределения.Для распределения множественных дисперсных размеров выборки EV распределение коэффициентов, выводимых из корреляционных функций диффузии, становится некорректной математической проблемой. Это означаетDLS не должен использоваться для определения количественных свойств образцов EVЕсли DLS не применяется к определенной части EV с одним дисперсионным размером. С другой стороны, DLS может быть использован для качественного подтверждения возможного присутствия субмикронных частиц и возможных кластеров в образцах EV.Различные электронные микроскопы (EM) являются одной из немногих технологий, которые могут обнаруживать EV (независимо от размера). Тем не менее, поток зеркал также означает, что более крупные EV статистически недооцениваются по сравнению с меньшими EV. SEM, TEM и Cryo - EM - это EV - представления с высоким разрешением, и им не нужно переключаться друг с другом или предоставлять изображения сопоставимого качества. Например,Cryo - EM может четко отображать двухслойную структуру липидов, поддерживая форму EV лучше, чем условия обезвоживания, используемые TEM для фиксированных образцов, и, возможно, более точно количественно (размер),Потому что все частицы в определенном объеме могут быть изображены, а не только те, которые прилипают к поверхности несущей сети.Стандартизированные исследования методов ЭМ для определения низких требований к отчетности были весьма ограниченными. Для TEM должны быть объявлены три основных параметра: метод фиксации, адсорбции и отрицательного окрашивания. Фиксирование включает: используемые фиксаторы, их концентрацию и время инкубации; Адсорбция включает в себя материал, несущий сетку, размер несущей сетки, тип пленки, покрытие, время инкубации и детали очистки; Подробная информация об отрицательном окрашивании должна включать субстрат, концентрацию и время инкубации. Кроме того, следует публиковать изображения с низким и высоким увеличением, а также критерии отбора изображений.[Отслеживание наночастиц]NTA， Также считается, что отслеживание одиночных частиц - это оптическая технология, широко используемая в области EV для оценки размеров и концентрации частиц. Обычно NTA использует алгоритмы, которые уменьшают изменение распределения диаметра, чтобы получить гидродинамический диаметр путем измерения коэффициента диффузии частиц. Примечательно, чтоАлгоритмы FTLA, используемые на некоторых устройствах NTA, были разработаны, чтобы лучше представлять однодисперсные смеси, в то время как EV нет, что может привести к искусственному множественному распределению соответствий.. И в настоящее время нет способа определить или опубликовать lod настроек NTA. Многие ученые провели несколько стандартизированных исследований, чтобы сравнить результаты между пользователями и приборами.Измерение диаметра распределения и концентрации сложных проб биожидкостей с помощью NTA должно быть тщательно интерпретированоПотому что он подсчитывает конгенеры, такие как липопротеины и макропротеиновые комплексы, иNTA трудно количественно определить EV диаметром более нескольких сотен нанометров.А.Опубликованная информация для NTA должна включать модель прибора, тип камеры, настройки камеры, длину волны лазера, мощность лазера, версию программного обеспечения, настройки анализа и частицы на кадр. Если известно, тоАлгоритмы, используемые для создания распределения диаметров, должны быть опубликованы, поскольку в зависимости от используемого алгоритма могут быть получены разные результаты.В случае обнаружения рассеяния света или флуоресценции рекомендуется использовать пустые буферы для сравнения. Для флуоресцентного NTA сообщается общее количество частиц в режиме рассеяния света и количество маркированных частиц в режиме флуоресценции, а также методы удаления меток и контроль буфера / реагента для оценки контрастности меток.Если используется устройство для отбора проб жидкости, его настройки также должны быть объявлены.А.[Импульсная индукция сопротивления]Это первый случай, когда MISEV использует метод индукции импульсов сопротивления (RPS) в качестве обычного метода представления частиц EV, рекомендованного наряду с методами, основанными на потоках (включая потоки на основе микрошариков и одновекторные потоки EV), и методами, основанными на микроскопах (включая атомные силовые микроскопы, электрические зеркала, DLS, NTA, микроскопы с гиперразрешением и т.д.). Это также одна из немногих неоптических методов представления EV.RPS использует принцип Курта для определения концентрации и диаметра частиц, а некоторые устройства также имеют потенциал зеты. В настоящее время RPS имеет диаметр lod до 50 нм.РПСРезультаты измерений действительноТЕМДанные имеют очень высокую степень согласованности.При представлении данных RPS рекомендуется публиковать модель прибора, апертуру, калибровку диаметра микрошарика и источник, а также версию программного обеспечения. Как упоминалось ранее (количественная величина размера частицы), для данных EV,Рекомендуется публиковать данные о распределении RPS по диаметру, а не по одному диаметру. Предлагается включить контраст пустого буфера, чтобы определить фон.А также те же концентрации дезактиватора после расщепления проб для определения маркировочных событий. Поскольку технология RPS может быть легко заблокирована более крупными частицами, для удаления более крупных частиц могут использоваться преданалитические шаги, такие как центрифуга или фильтрация. Поскольку эти методы могут изменять анализируемые группы ЭВ и влиять на сравнение с ортогональными методами, любые процедуры предварительной обработки должны быть четко определены.Необходимо предоставить подробную информацию о концентрации и количественных показателях белка; Если это возможно, необходимо включить положительные и отрицательные контрасты антигена; Если утверждается, что белок связан с EV, необходимо включить измерение чистоты препарата EV. Представление всей подробной информации о стандартизированных образцах, гелевом электрофорезе, трансмембранных методах, зондах и условиях получения изображений / анализа (включая, но не ограничиваясь этим, информацию об антителах, условиях дегенерации и восстановления образцов, трансмембранных методах, типах мембран, буферных растворах и устройствах и параметрах получения изображений); Предоставляет все необрезанные изображения WB (если они публикуются в журнале, это необходимо в качестве дополнительной информации).В предыдущих разделах руководства рассматриваются различные подходы к представлению EV и содержатся конкретные рекомендации. Независимо от используемого метода, общая рекомендация, представленная ниже, резюмируется следующим образом:
- Каждый препарат EV должен быть определен количественными измерениями источника EV (например, количество секреционных клеток, объем биожидкости, качество ткани и т.д.).
- Следует оценить плотность EV (включая количество частиц, содержание белка и / или липидов).
- Препарат EV должен быть проверен на наличие компонентов, связанных с подтипом EV или EV, в зависимости от особенностей, необходимых для экспериментальной цели.
- Определение степени присутствия не пузырьковых, совместно выделенных компонентов.
- При использовании количественных индикаторов для обозначения EV необходимо указать предел обнаружения прибора или метода (LOD).
