Синтезатор нуклеиновых кислот является основным оборудованием современных исследований и разработок в области молекулярной биологии, геномики и биомедицины, способным эффективно и точно синтезировать определенные последовательности ДНК или RNAoligonucleotide (олигонуклеотиды) вне организма.Его технические принципы объединяют технологию твердофазного синтеза, органическую химию и точное автоматизированное управление для достижения « написания по требованию» генетического кода жизни.

　　Основные принципы: химия твердых фосфатов

В настоящее время основные технологии синтеза нуклеиновых кислот основаны на принципе твердофазного синтеза, ядром которого является химия фосфата амина. Этот метод отличается высокой эффективностью, высокой производительностью и простотой автоматизации, заменив более ранний метод диэфира фосфата и метод триэфира фосфата. Весь процесс синтеза осуществляется в синтетической колонне прибора, а направление синтеза целевой цепи - от 3 'до 5'.

Цикл синтеза состоит из четырех основных этапов:

1. Снятие защиты:

Синтез начинается с первого нуклеотида, который ковалентно связан с твердофазным носителем. 5 '- гидроксильная группа нуклеотида закрыта защитной группой. Первым шагом цикла является промывание синтетической колонны кислотным раствором, снятие защитной базы DMT с первого 5 - го конца нуклеотида, обнажение активных 5 - гидроксильных радикалов и подготовка к следующей реакции сцепления. Снятые катионы DMT имеют оранжевый цвет и могут контролировать эффективность синтеза в режиме онлайн с помощью фотометрического метода.

2. Активация и связь:

Затем прибор накачивает следующий нуклеотидный мономер и активирующий агент, которые должны быть подключены к синтетической колонне одновременно. Сам нуклеотидный мономер очень активен, его 3 'конец защищен фосфатными амидными группами, а 5' конец защищен DMT, и на оснований также есть соответствующие защитные радикалы.

Активатор активирует 3 'фосфатные амидные группы нуклеотидных мономеров, что делает его хорошим электрофильным реагентом. Затем он быстро реагирует на нуклеотидное замещение с 5 'гидроксильными радикалами, которые были обнаружены на твердофазном носителе, образуя триэфирные связи фосфатов, которые добавляют новые нуклеотиды к удлиняющейся цепочке олигонуклеотидов.

3. Крышка:

Смешанные шаги не на 100% эффективны, всегда есть очень мало цепочек 5 '- гидроксильных радикалов, которые не участвуют в реакции. Если эти неудачные последовательности не будут закрыты, они будут продолжать участвовать в реакции в последующем цикле, создавая побочные продукты отсутствующих последовательностей.

Шаг « крышка» использует смесь двух реагентов для ацетилирования уплотнения неактивных 5 '- гидроксильных радикалов, делая их перманентными инактивированными. Эти « крышки» короткие цепи удаляются при окончательной очистке, что значительно повышает точность последовательности и чистоту конечного продукта.

4. Окисление:

Предыдущая стадия сцепления образует нестабильные триэфирные связи фосфата, которые легко разлагаются кислотой. Этот шаг вводит смешанный раствор йода / воды / пиридина, окисляя его в более стабильные триэфирные связи фосфата, тем самым завершая полный цикл добавления нуклеотидов.

После этого прибор автоматически повторяет вышеупомянутые четыре шага « дезактивация → сцепление → крышка → окисление», добавляя новый нуклеотид в каждый цикл до тех пор, пока вся целевая последовательность не будет полностью синтезирована.

　　II. Постсинтетическая обработка

После того, как синтезатор нуклеиновой кислоты завершает сборку цепи, полученный продукт остается необработанным продуктом ДНК, прикрепленным к твердофазному носителю, и все группы защищены. В этой связи необходимо принять последующие меры:

Резка и снятие защиты: обработка концентрированным раствором аммиака, с одной стороны, отрезает синтетическую цепочку олигонуклеотидов от носителя CPG, а с другой - синхронно удаляет защитную группу на всех основаниях и группу DMT в конце цепи.

2. Очищение: В соответствии с требованиями применения, очистка может быть проведена с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) или электрофореза с полиакриламидным гелем (PAGE) и т. Д. Для удаления неисправных последовательностей и побочных продуктов и получения конечного продукта высокой чистоты.

　　III. РЕЗЮМЕ

По сути, синтезатор нуклеиновых кислот представляет собой высокоавтоматизированный прецизионный органический химический реактор. Он обеспечивает быстрый, высокопроизводительный и точный синтез DNA / RNAoligonucleotide, разбивая сложные синтетические химические реакции на ряд программируемых контролируемых стандартизированных шагов и точно контролируя скорость потока жидкости, количество реагентов и время реакции с помощью компьютера. Зрелость и популярность этой технологии в значительной степени способствовали быстрому развитию передовых технологий, таких как редактирование генов, тестирование PCR, препараты нуклеиновой кислоты и хранение ДНК.