Анатомия флуоресцентного микроскопа Олимпа

2018 / 7 / 26 7: 52: 45 Издатель: admin

& Другие характеристики, основанные на макроскопической выборкеОптический микроскопПо сравнению с моделями, такими как фазовый градиент, поглощение света и двойное преломление, флуоресцентный микроскоп способен визуализировать распределение отдельных типов молекул только на основе характеристик флуоресцентной эмиссии. Таким образом, с помощью флуоресцентной микроскопии можно контролировать точное местоположение внутренних компонентов клеток, отмеченных конкретными флуоресцентными скоплениями, а также связанные с ними коэффициенты диффузии, характеристики транзита и другие.БиологияМолекулярное взаимодействие. Кроме того, заметная реакция флуоресценции на локальные переменные среды позволяет изучать pH, вязкость, скорость преломления, концентрацию ионов, мембранный потенциал и полярность растворителя в живых клетках и тканях.

Ранняя конфигурация флуоресцентного микроскопа с использованием классического пропускания открытого или темного поля (Проницаемый свет)Оптическая системаФокусируйте возбужденный свет через фильтр на плоскость образца. Через объектив собираются флуоресцентные излучатели и большое количество возбуждающего излучения, которое проецируется в диафрагму окуляра через второй фильтр для формирования промежуточного изображения. Поскольку интенсивность излучения, как правило, на несколько порядков больше, чем флуоресцентное излучение, отображение образцов в этих ранних световых микроскопах обычно имеет очень низкий контраст и накладывается на фон, полный рассеянного возбужденного излучения. Облучение проб с высоким азимутальным углом наклона с использованием конденсаторов с высокой численной апертурой, пропитанных масляным полем, помогло устранить большую часть фонового шума, но не обеспечило достаточного освещения, за исключением объективов с низкой апертурой. Полученные изображения имеют плохое разрешение и очень низкую яркость.

Рентгеновский микроскоп (Отраженный светОсвещение было впервые разработано в конце 1920 - х годов для наблюдения за флуоресцентным излучением в непрозрачных металлургических образцах. Как и их аналоги с открытым полем, эти отражающие люминесцентные приборы используют полуотражающие лучевые распределители, общая эффективность которых составляет около 25% (потеря 50% освещенности после каждого прохода через зеркало). Тем не менее, рефлекторный флуоресцентный микроскоп обладает преимуществами как объектив с высокой численной апертурой в качестве концентратора и способен генерировать изображения значительно более высокого уровня, чем линзовый световой микроскоп, работающий с аналогичной численной апертурой. Кроме того, рассеянное излучение рефлекторного объектива (при высокой числовой апертуре) уменьшается до нескольких процентов. Двойная роль объектива в отражательной микроскопии также значительно упрощает задачу выравнивания. Сосредоточив объектив только на образце, было установлено световое поле и поле зрения, так что падающий возбуждающий свет и наблюдаемая флуоресцентная эмиссия следуют тому же пути, что и оптическая серия через микроскоп.

Когда в середине 1930 - х годов были разработаны компактные ртутные пары и ксеноновые дуговые разрядные лампы, технологические достижения в осветительных источниках света способствовали переходу на рефлекторную флуоресценцию (по крайней мере, для металлографии). За это время цветные стеклянные и желатиновые фильтры также стали более сложными, что позволило использовать гало - вольфрамовые лампы для применения флуоресцентных красителей, возбужденных синим и зеленым видимым светом. Антирефлекторное покрытие и улучшенная стеклянная формула привели к значительным улучшениям в дизайне объектива в 1940 - х годах, но фундаментальным вкладом в развитие флуоресцентной микроскопии падающего света стало введение дихроматического спектроскопа (также известного как дихроматоскоп), начатого российским оптическим ученым Евгением Брумбергом в 1948 году. Это новшество преодолевает проблему потери света, присущую использованию обычных полузеркал в отражательной микроскопии. Рентгеновская флуоресцентная микроскопия была широко коммерциализирована Йоханом С. Плоем в конце 1960 - х годов, который сыграл важную роль в разработке Wild - Leitz Ploem Opak, который включает в себя несколько взаимозаменяемых оптических модулей и оснащен различными комбинациями фильтров флуоресцентной микроскопии.

Основные стратегии флуоресцентного микроскопа

Флуоресцентные микроскопы, отражающие свет, в подавляющем большинстве являются текущими методами отбора для широкополосных исследований некогерентных источников света, а также для лазерного сканирования с общей фокусировкой и многофотонными приборами. Этот популярный режим флуоресцентной микроскопии также известен как падающая флуоресценция, отражающая флуоресценция или просто падающая флуоресценция. Типичный современный рефлекторный флуоресцентный микроскоп также оснащен различными световыми наблюдениями в режиме усиления контрастности, как показано на рисунке 1. Микроскоп содержит трехглазую головку наблюдения, связанную с системой камер ПЗС (ПЗС), с двумя источниками освещения, один для пропускания света, а другой для наблюдения (вольфрам - галоген и ртутный дуговой разряд соответственно). Разработанный микроскоп может комбинировать или чередовать фазовый контраст между отраженным светом флуоресценции и пропускаемым светом, дифференциальный интерферометрический контраст (DIC), поляризованный свет или модуляцию Гофмана для наблюдения контраста.

Основной особенностью любого флуоресцентного микроскопа является обеспечение механизма возбуждения образца, который имеет селективную фильтрацию освещения, а затем использует второй фильтр для разделения более слабой флуоресцентной эмиссии, чтобы сформировать изображение с большой чувствительностью на темном фоне. Во многих экспериментах локальные концентрации зондов в биологических образцах были очень низкими, и лишь небольшая часть испускаемого света была поглощена флуоресцентным материалом. Кроме того, в флуоресцентных скоплениях, способных поглощать определенное количество облучения, процент вторичной флуоресценции еще ниже. Полученный уровень яркости флуоресценции будет на три - шесть порядков ниже, чем уровень яркости освещения. Таким образом, основной проблемой флуоресцентного микроскопа является высокоэффективное освещение, которое производит образцы, захватывая слабые флуоресцентные излучатели, которые эффективно отделены от более интенсивных полос облучения. В современных флуоресцентных приборах эти условия удовлетворяются комбинацией фильтров, основанных на функциях и характеристиках дихроматического спектрометра, которые координируют требования к возбуждению и излучению.

На рисунке 2 показан принцип, лежащий в основе функции дихроматического спектрометра (зеркала) в рефлекторно - люминесцентном микроскопе, который содержит гипотетический образец флуоресцентного скопления, возбуждающего и испускающего флуоресценцию на красных (620 - 660 нм) длинах волн в зеленой зоне (550 нм). Видимый спектр. Высокоинтенсивные источники света выводят длины волн возбуждения в широком диапазоне с высокой плотностью потока (обычно покрывающей большую часть ультрафиолетового излучения и весь спектр видимого излучения), которые проходят через осветительные приборы и первыми сталкиваются с фильтрами, которые выбирают подходящий диапазон возбуждения (отмеченный EF; см. рис. 2 (a)). В этом случае фильтр пропускает свет на длинах волн от 510 до 560 нанометров с высокой эффективностью, но также позволяет другим длинам волн проходить в меньшей степени. Затем возбужденный свет достигает дихроскопа (DM на рисунке 2) и отражается в заднем отверстии объектива, чтобы сформировать коническое освещение облученного образца. Двухцветные зеркала, расположенные в оптическом пути под углом 45 градусов, предназначены для выборочного отражения длин волн между 490 и 565 нм (как показано на рисунке 3) при передаче более коротких и более длинных длин волн.

На рисунке 3 показана кривая пропускания, используемая для комбинации фильтров, которые отделяют возбуждающий свет от флуоресцентного излучения на рисунке 2. Спектр возбуждающего фильтра (красная кривая) показывает высокий уровень пропускания (около 80%) между 510 и 560 нанометрами. Центральная длина волны (CWL) 535 нм. Дихроскопические (желтые кривые) отражатели возбуждают длины волн в спектральных областях при относительно высокой эффективности прохождения через более высокие и более низкие длины волн. Обратите внимание, что процентная проницаемость на кривой дихроматического отражения соответствует 100 - процентному отражению. Значительное снижение в распределении пропускания между 490 и 570 нм (которое представляет собой пик альбедо) используется для отражения полосы длин волн, которая поступает в образец от возбуждающего фильтра под углом 90 градусов. Последний компонент в оптическом ряду, то есть излучающий или барьерный фильтр (белая кривая), пропускает длину волны выше 590 нанометров, что соответствует видимому свету с желтым, оранжевым и красным. Границы между полосами пропускания и отражения различных суперспектров спроектированы так, чтобы быть как можно более крутыми, чтобы обеспечить почти * разделение длин волн отражения и пропускания. Появление синусоидальных восходящих и нисходящих пиков в спектре дихроматоскопов является распространенным эффектом процесса осаждения тонкой пленки, называемого бесконечным звуком. Эта комбинация фильтров обладает отличной производительностью и наглядно демонстрирует быстрое развитие технологии тонкопленочных интерферометрических фильтров.

Поскольку только свет с узкой полосой пропускания отражается в двухцветных зеркалах, длина волны облучения, которая пытается вызвать фильтр, короче 490 нм и длиннее 565 нм, также передается через дихроматоскоп, как показано светом над отсеком. На диаграмме 2 (a). Обратите внимание, что рефлексы от возбуждения света не на 100% эффективны, поэтому небольшое количество зеленого света проходит через дихроматоскопы и не отражается. Кроме того, не весь свет с длиной волны более 565 или менее 490 нм проходит через зеркало. Небольшая часть этого света отражается зеркалом на образце через объектив.

Флуоресцентная эмиссия образцов (в основном красных длин волн), генерируемых зеленым светом, накапливается объективом и проходит через дихроматоскоп и барьерный фильтр (на рисунке 2 (c) свет останавливается выше). Барьерные фильтры (помеченные как BF на рисунке 2, специально разработаны, чтобы позволить только свету с длиной волны более 590 нм достигать микроскопических окуляров и / или детекторов. При выполнении этой задачи барьерный фильтр эффективно предотвращает попадание в детектор волн возбужденного света, отраженных от образца (и успешно проходящих через дихроматоскоп). Однако большая часть длины волны возбуждения, возвращаемой из образца, отражается дихроскопом (свет ниже запирающего света на рисунке 2 (c)) в возбуждающем фильтре и светоизлучающем устройстве. Чистый эффект конфигурации фильтра, показанной на рисунках 2 и 3, состоит в том, чтобы отделить значительно более интенсивный возбуждающий свет от более слабой флуоресцентной эмиссии. Во всех случаях, как показано на рисунке, уровень отсечения фильтра, задействованного в флуоресцентной микроскопии, не является, но может позволить некоторым лучам проникнуть за пределы диапазона длин волн. Вся последовательность событий графически показана на рисунке 2 (b), где показаны оптические пути и расположение стратегических фильтров, необходимых для эффективного отражения флуоресцентного микроскопа.

вертикальный люминесцентный светильник

В основе современного флуоресцентного микроскопа лежит универсальный отражательный вертикальный осветительный прибор, подключенный к наблюдательной трубке и переносящий объектив.ОбъектМежду конвертерами, как показано на рисунках 1 и 4. Светильник предназначен для наведения света, генерируемого высоким светом - источник прочности помещается на образец, сначала направляя свет через микроскопический объектив в сторону образца, а затем захватывая свет, испускаемый образцом, с помощью того же объектива. Этот тип стратегии освещения имеет несколько преимуществ. Микроскопический объектив сначала служит хорошо отрегулированным конденсатором, а затем собирает флуоресцентные излучатели изображений для передачи в окуляр или систему обнаружения камеры. Поэтому объективы всегда правильно выравниваются относительно каждой функции. Кроме того, большая часть излучаемого излучения, рассеянного или отраженного образцом (под углом 360 градусов), удаляется от элементов передней линзы объектива, а не проецируется непосредственно на стекло, например, в случае линзового флуоресцентного облучения. Этот эффект известен как фронтальное освещение, особенно для толстых образцов. После этого облученная область образца была ограничена той же областью, что и наблюдаемая, и как освещение, так и сбор света могли использовать полную числовую апертуру объектива.

На дальнем конце вертикального светильника находится световая коробка (см. рисунок 4), которая содержит высокоинтенсивный дуговой разряд или источник света лампы накаливания на основе проволоки. Популярными источниками света являются ртутные дуговые лампы высокого давления мощностью 100 Вт (HBO, обычно называемые горелками), но для этой цели также могут использоваться ксеноновые и металлические галогенированные дуговые лампы, лазеры и галогенированные вольфрамовые лампы накаливания. Свет, излучаемый источником света, фокусируется системой концентрированных линз и движется по внутренней части осветительного прибора, параллельного рабочему столу и перпендикулярного световой оси микроскопа. Конструкция светоизлучателя, показанная на рисунке 4, включает в себя многокомпонентную коллекторную линзовую систему, но также включает в себя асферические линзовые элементы для улучшения коррекции хроматизма в ближней инфракрасной и ультрафиолетовой областях. Тепловые фильтры, предназначенные для удаления или подавления инфракрасных длин волн, размещаются внутри самого светового ящика или рядом с задней частью вертикального освещения. Кроме того, некоторые микроскопы содержат двухчастотные или многочастотные системы балансировки возбуждения вблизи световых коробок (см. рисунки 4 и 8), которые избирательно фильтруют нежелательные длины волн для точной настройки производительности группы флуоресцентных фильтров, содержащихся на другом конце осветительного устройства.

Также рядом с световой коробкой в вертикальном освещении находится набор фильтров нейтральной плотности, которые могут использоваться для регулирования общей интенсивности света, проходящего через систему, и уменьшения флуоресцентного обесцвечивания или отбеливания света. Эти фильтры обычно устанавливаются на раму ползунка, что позволяет быстро вставлять световые пути и удалять их из световых путей, наблюдая за флуоресценцией образца. Чтобы установить освещение Köhler, вертикальный осветительный прибор содержит среднюю диафрагму и диафрагму поля зрения, оба из которых имеют переменную апертуру диафрагмы, которая определяет размер поля и интенсивность освещения. Регулирование диафрагмы отверстия и полевой диафрагмы, а также размеров диафрагмы осуществляется несколькими ручками, расположенными на каждой внешней стороне корпуса вертикального осветительного прибора. В некоторых конструкциях предоставляется ручка ползунка, которая удаляет весь блок диафрагмы со светового пути, чтобы увеличить количество света, проходящего через осветительный прибор. Другие микроскопы содержат иголки фиксированного размера, установленные на ползунке, которые могут быть вставлены в световые пути, что значительно ограничивает осветительные поля и подходит для специальных применений, таких как флуоресцентное восстановление (FRAP) обследования после отбеливания света.

За полевыми диафрагмами и диафрагмами в оптической линейке вертикальных осветительных приборов следует полевая линза, которая необходима для диффузии света и создания достаточного количества осветительных полей для установки освещения Koller. За зеркалом присутствия все современные вертикальные осветительные приборы содержат световой затвор (с ручным переключателем управления), который не позволяет интенсивному излучению достигать группы фильтров и образцов, когда нет наблюдения или записи флуоресценции. Затвор является ключевой особенностью флуоресцентной микроскопии, поскольку непрерывное облучение образца может значительно уменьшить излучение, вызванное отбеливанием света, в то время как высокоинтенсивный свет нездоров для живых клеток. Кроме того, затвор удерживает дуговые разрядные лампы в активном состоянии (уменьшает время подогрева), в то время как образец мгновенно проверяется пропускающим светом. Флуоресцентные микроскопы обычно оснащены электронными затворами, которые позволяют быстро и дистанционно управлять освещением. Защита от ультрафиолетового излучения (на рисунке 4 показан респираторный экран, установленный в передней части корпуса светильника для защиты оператора от случайной утечки потенциально опасного коротковолнового ультрафиолетового излучения при открытии затвора).

Несколько вертикальных осветительных приборов спроектированы таким образом, чтобы обеспечить желоб для прямоугольной поляризационной рамы, которая может быть использована для изучения флуоресцентной поляризации. В большинстве случаев поляризатор вставляется в осветительный световой путь за полевым зеркалом (вдали от сопряженной плоскости), но перед световым затвором (см. рисунок 4). Поляризатор может быть закреплен на месте заданным азимутом пропускания или установлен на комплекте передач, что позволяет изменять направление оси пропускания с помощью пальцевого колеса. Поскольку поляризаторы установлены в скользящей раме, их можно легко удалить из светового пути, когда они не используются. Сопряжённый анализатор (второй поляризатор, необходимый для измерения флуоресцентной анизотропии) может быть установлен в вертикальном освещении над башней фильтра или в специально разработанной промежуточной трубке поляризованного микроскопа. Вспомогательные трубки обычно могут вставлять градиентные вращающиеся поляризационные блоки, чтобы обеспечить точное позиционирование ориентации пропускания анализатора относительно оптической оси поляризатора и микроскопа.

Задняя ступень вертикального освещения содержит вращающийся поворотный стол или скользящую опору, которая содержит оптические блоки, содержащие комбинацию флуоресцентных фильтров. Когда требуется комбинированное изображение с использованием определенного флуоресцентного фильтра, блок фильтра вращается (или скользит) в оптическую серию. Отдельные блоки содержат соответствующий набор возбуждающих и излучающих фильтров, а также дихроматических спектроскопов, все из которых тщательно локализованы, чтобы значительно увеличить облучение образца и захватить флуоресцентную эмиссию на определенной длине волны. Оптические блок - поворотные башни и ползунки могут загружать от трех до шести отдельных блоков, один из которых находится в световом пути, в то время как другие вращаются или скользят во временном хранилище. При наблюдении образцов, отмеченных двумя или более флуоресцентными зондами, эти аксессуары могут быть быстро преобразованы между наборами флуоресцентных фильтров. В микроскопах оснащенных флуоресцентными осветительными приборами использование просвечивающего освещения облегчается виртуальными оптическими блоками в канавках установленных на роторе или опоре ползуна. Виртуальный блок блокирует запуск возбуждения (когда затвор открывается), но не содержит никаких фильтров и позволяет свету беспрепятственно проходить через наблюдательную трубку из объектива.

В стандартном модульном вертикальном микроскопе вертикальный светильник расположенМикроскопМежду рамкой и трубкой наблюдения (см. рисунок 1). Многие производители предлагают промежуточные трубки, которые могут быть вставлены между осветительными и окулярными элементами для поляризаторов, DIC - призм или других аксессуаров. Современные микроскопические рамки часто являются результатом усилий по проектированию с помощью компьютеров, которые приводят к значительным амортизационным и улучшенным эргономическим характеристикам. Синтетические материалы, такие как керамические и алюминиевые композиты на основе металлов, могут значительно улучшить статическую и термическую жесткость рамы, что позволяет прибору выдерживать строгие требования передовых методов флуоресценции, которые требуют устранения вибрации в течение длительного времени * для получения изображений слабой флуоресцентной эмиссии.

Освещение с помощью флуоресцентного микроскопа Köhler

В флуоресцентных вертикальных осветительных приборах источник света позиционируется таким образом, что плазменный шар с тонким или дуговым разрядом находится вблизи основного фокуса концентрирующей линзы. В освещении Köhler прожекторная линза служит значительно увеличенным вспомогательным источником света для улучшения общего освещения. Одно из основных требований освещения Köhler заключается в том, что изображение нити накаливания или дуги должно быть в конечном итоге проецировано на заднюю фокальную плоскость объектива, которая в два раза больше (обычно с высокой численной апертурой) концентратора во время возбуждения отраженного света. В идеале источник света должен заполнять всю апертуру объектива, чтобы увеличить интенсивность излучения и создать поле равномерного облучения. В некоторых случаях горячие точки). Однако, поскольку диффузионные фильтры также снижают освещенность, их следует по возможности избегать.

В отраженном освещении Köhler (иллюстративно показано на рисунке 5) изображение источника света фокусируется фокусирующейся линзой на диафрагме диафрагмы с апертурой, расположенной в вертикальном освещении. Эта диафрагма имеет сопряжённую плоскость с задним отверстием объектива и дугой лампы или нитью накаливания, поэтому размер отверстия поля для облучения определяется. Источники света, диафрагма апертуры вертикального осветительного прибора и задняя фокальная плоскость объектива (зрачок) вместе образуют группу освещения сопряжённой плоскости. В отличие от ситуации с линзовым световым микроскопом, диафрагма с апертурой и источник света изображены на плоскости задней апертуры объектива (выступающего в качестве концентратора), а не физически расположены в этом положении. В качестве дополнительного преимущества этой конфигурации все препятствия (например, диафрагма радужной оболочки) удаляются из светового пути, когда объектив обеспечивает возбужденное облучение или образует изображение из концентрированного флуоресцентного излучения. Включение или выключение диафрагмы с апертурой используется для управления рассеянием света и регулирования интенсивности освещения (числовая апертура) без изменения размера осветительного поля. В изображении настройка диафрагмы апертуры влияет на яркость и контраст.

Изображение или набор полей сопряжённых плоскостей в отраженном освещении Köhler состоит из диафрагмы поля, поверхности образца и промежуточной плоскости изображения. Поэтому, когда диафрагма фокусируется на плоскости образца на месте, изображение источника света значительно удаляется из фокуса, чтобы обеспечить равномерное поле освещения. Диафрагма поля зрения регулирует размер поля облучения, не влияя на интенсивность освещения в наблюдаемой области. На практике размер отверстия диафрагмы поля должен быть как можно меньше, чтобы увеличить контрастность изображения и уменьшить степень отбеливания света в районах, которые непосредственно не наблюдаются. Несмотря на то, что интенсивность освещения, создаваемого большинством дуговых разрядов и источников света накаливания, неравномерна, освещение Köhler может равномерно освещать поле проб. После правильной настройки микроскопа задняя фокальная плоскость объектива * освещается, обеспечивая равномерно яркую область от края до края. В идеале освещение Köhler купает образцы с набором сходящихся волновых фронтов, каждый из которых формируется отдельными точками на источнике света, которые отображаются в апертуре концентратора. В правильно настроенном флуоресцентном микроскопе получается контрастность и разрешение изображения. В идеале образец купается в наборе сходящихся волновых фронтов, каждый из которых генерируется различными точками на источнике света, изображенном на апертуру конденсатора. В правильно настроенном флуоресцентном микроскопе получается контрастность и разрешение изображения. В идеале образец купается с набором сходящихся волновых фронтов, каждый из которых отображаетсяконденсаторИсточники света с апертурой образуются в разных точках. В правильно настроенном флуоресцентном микроскопе получается контрастность и разрешение изображения.

Источники света и маяки

Для строго количественного анализа в флуоресцентной микроскопии облучение образца должно быть постоянным во времени и пространстве на протяжении всего поля зрения. Нестабильность во времени обычно отражает колебания излучения лампы, возникающие из - за изменения выхода питания. Напротив, пространственные возмущения, часто встречающиеся в дуговых лампах, происходят из явления, называемого миганием, поскольку плазменные шары перемещаются по электродам. Сцинтилляция обычно возникает из - за колебаний питания, небольших изменений сопротивления электрода или механической вибрации. Источники света, основанные на нитях накаливания, такие как популярные галоидированные вольфрамовые лампы, очень стабильны при работе при постоянном постоянном токе с использованием стабилизатора напряжения. Как правило, источник света должен быть выбран из его спектрального содержания, размера нити накаливания по сравнению с областью задней апертуры объектива, пространственной и временной стабильности и однородности освещения поля. Особое внимание следует также уделять интенсивности источника света, поскольку узкополосные длины волн, проходящие через возбуждающий фильтр, включают в себя только очень небольшую часть общего выхода светоизлучателя.

Основными соображениями при выборе источника света для флуоресцентной микроскопии являютсяФлуоресцентные красителиКвантовая производительность и поглощение, связанные с спектральным распределением ультрафиолетового и видимого света. Кроме того, источник света должен быть совместим с чувствительностью детектора, используемого для захвата изображений, будь то человеческий глаз, традиционная пленка, фотоумножитель, усовершенствованная видеотрубка или система цифровой камеры. Выбор также зависит от режима освещения. Требования широкополосной флуоресцентной микроскопии удовлетворяются с помощью дугового разряда или вольфрамово - галогенного источника, в то время как конфокальные и многофотонные микроскопы должны быть адаптированы к различным лазерным системам. Использование вольфрамовых и вольфрамово - галогенных ламп накаливания имело ограниченный успех, поскольку большая часть их излучения происходит в красных и инфракрасных областях спектра, в то время как большинство флуоресцентных скоплений возбуждаются ультрафиолетовыми, синими и зелеными длинами волн. Кроме того, световой выход дуговых разрядных ламп в 10 - 100 раз ярче, чем 12 - вольтная кварцевая галогенная лампа, обычно используемая для пропускания света. Популярным источником света для широкоугольной флуоресцентной микроскопии является ртутная дуговая лампа, которая обычно включена в конфигурацию базовой модели микроскопа. В некоторых случаях используются ксеноновые и металлические галогенированные дуговые лампы, но они обычно ограничиваются конкретными случаями, когда спектральное распределение и распределение интенсивности соответствуют требованиям конкретных флуоресцентных масс.

Ртутные и ксеноновые лампы имеют аналогичную конструкцию, за исключением физических размеров и газов в корпусе лампы. Амальгамная лампа содержит два электрода, запечатанных под высоким давлением в кварцевом стеклянном светильнике, который также содержит испаряющуюся элементарную ртуть. Когда источник питания включен, ряд импульсов высокого давления отправляется на электрод, ионизируя небольшую часть ртутного газа и зажигая лампу. После сжигания напряжение снижается, а ионизирующий газ используется для переноса тока и создания плазменных сфер, образующихся между двумя электродами. Во время работы лампы испарение ртути производит большое количество тепла и давления в стеклянных лампах, что в конечном итоге приводит к высокой интенсивности света. Свет, генерируемый ртутными дуговыми лампами, непрерывно, даже в ультрафиолетовом и видимом спектральных диапазонах, концентрируется в дискретных длинах волн 365 400 440 546 и 580 нм. От ультрафиолетовых до инфракрасных лучей ксеноновые лампы имеют более равномерное распределение интенсивности по всему спектральному диапазону. Выбор флуоресцентных красителей имеет решающее значение для определения подходящего источника света для флуоресцентного микроскопа. Некоторые флуоресцентные зонды имеют зоны возбуждения, которые совпадают с выделенными ртутными линиями, в то время как другие получают выгоду от более равномерного распределения излучения ксеноновых ламп.

Правильное выравнивание дуговых ламп в флуоресцентном микроскопе имеет решающее значение для обеспечения освещения Колера и предотвращения светлых и темных областей на флуоресцентных изображениях. Таким образом, качество световой коробки обычно можно определить по стабильности правильного выравнивания лампы и эффективности ручки регулирования, используемой для поддержания выравнивания. Лампа должна быть оснащена ламповым шурупом для центрирования дугообразного изображения в заднем отверстии объектива, а световой ящик должен содержать инфракрасный фильтр, который блокирует длинные длины волн в дальнем красном и инфракрасном диапазонах, создавая большое количество тепла. Некоторые световые ящики спроектированы со встроенным красным ингибирующим фильтром (например, Schott BG38) или канавками для этого фильтра, чтобы устранить красный фон, который вы видите через поле зрения в некоторых приложениях. Кроме того, сама световая коробка не должна пропускать вредные ультрафиолетовые длины волн и предпочтительно включать переключатели для автоматического выключения света, если корпус случайно включен во время работы. После этого световая коробка должна быть достаточно прочной, чтобы выдерживать возможные взрывы горелки во время работы.

Широкое разнообразие применений флуоресцентной микроскопии обычно требует ряда источников света для удовлетворения требований конкретных флуоресцентных групп и условий изображения. В некоторых случаях комбинация со сверхчувствительной камерой может потребовать очень низкого излучения, в то время как для других исследований может потребоваться сильное лазерное возбуждение, чтобы убить живые клетки или избирательно отбеливать флуоресцентные массы. Требования к длине волны обычно охватывают всю видимую область спектра, а также ультрафиолетовые и инфракрасные части. Поскольку один источник света не может удовлетворить эти несколько требований к освещению, адаптеры, предлагаемые производителями в настоящее время, могут одновременно подключать две или более ламп к одному микроскопу.

комбинация флуоресцентных фильтров

Как упоминалось ранее, свет, проходящий через линзу и диафрагму вертикального осветительного прибора, в конечном итоге сталкивается с возбуждающим фильтром, размещенным в оптическом блоке, который совпадает с осевым пересечением светового пути осветительного прибора и оптической системы микроскопа. Фильтр возбуждения выбирает узкополосную длину волны из широкого спектра, создаваемого лампой, и передает ее в дихроматор, который, в свою очередь, отражает свет через объектив и освещает образец. Перед формированием изображения в диафрагме фиксированного окуляра флуоресцентная эмиссия, собранная объективом, снова проходит через дихроматоскоп и излучающий или барьерный фильтр. Обычные фильтры, используемые для разделения диапазонов в широкополосной флуоресцентной микроскопии, включают цветные стеклянные и интерферометрические тонкопленочные фильтры (или комбинации обоих). Определение подходящего фильтра для каждого шага в схемах освещения и визуализации флуоресцентной микроскопии может вызвать путаницу, так как задействовано большое количество производителей фильтров, каждый из которых предлагает собственное алфавитно - цифровое наименование для флуоресцентной литературы.

На рисунке 7 показаны типичныеБлок флуоресцентного возбужденияАнатомические структуры, а также дихроматоскопические, возбуждающие и барьерные фильтры, связанные с спектральными контурами. Фильтрующие блоки обычно собираются с помощью индивидуального инструмента, предоставленного производителем, поэтому оператор может обмениваться фильтрами и дихроскопами. Фильтры возбуждения и барьера закрепляются на месте с помощью фиксированного зажима, оптического клея или круглых резьбовых установочных сидений (см. рисунок 7). Как правило, эти фильтры могут быть удалены без включения оптических блоков, поскольку они расположены над впадинами на плоской внешней поверхности. Замена дихроматоскопа более сложна и требует * демонтажа блока, чтобы попасть внутрь. Большинство блоков отлиты диагональными разъемами 45 градусов, что позволяет выполнять двойные задачи, защищая интерьер и поддерживая дихроскопы под соответствующим углом. После удаления крепежного элемента (штифта или небольшого винта), который удерживает части блока вместе, зеркало можно снять, отпустив или переместив крепежный зажим, а затем осторожно удалить его из блока. Дихроскопы следует обрабатывать с осторожностью, поскольку интерферометрические покрытия обычно не защищены и легко царапаются. Несколько производителей фильтров, поставляющих микроскопические компании, также предлагают широкий спектр послепродажных фильтров и дихроматоскопов для различных флуоресцентных применений. После удаления крепежного элемента (штифта или небольшого винта), который удерживает части блока вместе, зеркало можно снять, отпустив или переместив крепежный зажим, а затем осторожно удалить его из блока. Дихроскопы следует обрабатывать с осторожностью, поскольку интерферометрические покрытия обычно не защищены и легко царапаются. Несколько производителей фильтров, поставляющих микроскопические компании, также предлагают широкий спектр послепродажных фильтров и дихроматоскопов для различных флуоресцентных применений. После удаления крепежного элемента (штифта или небольшого винта), который удерживает части блока вместе, зеркало можно снять, отпустив или переместив крепежный зажим, а затем осторожно удалить его из блока. Дихроскопы следует обрабатывать с осторожностью, поскольку интерферометрические покрытия обычно не защищены и легко царапаются. Несколько производителей фильтров, поставляющих микроскопические компании, также предлагают широкий спектр послепродажных фильтров и дихроматоскопов для различных флуоресцентных применений.

Дизайн флуоресцентных фильтров включает в себя длинные, короткие полосы (краевые фильтры), а также узкополосные, среднеполосные и широкополосные серии фильтров. Спектр, показанный на рисунке 7, показывает несколько примеров общих профилей фильтра. Спектр эмиссионного фильтра (синяя кривая) на рисунке 7 генерируется длинным интерферометрическим фильтром с длиной волны отсечения около 575 нм. Более длинные волны передаются через фильтр, а более короткие блокируются. Узкокополосный фильтр возбуждения пропускания из той же группы (красная кривая, рисунок 7) имеет полосу пропускания около 20 нм, в то время как дихроскоп (зеленая кривая) имеет область пропускания, приближенную к средней (455 - 490 нм), и широкополосный фильтр пропускания (560) - 775 нм). Поскольку дихроматоскоп эффективно используется в качестве длиннополосного фильтра в зеленом, желтые и красные области видимого спектра (от 560 до 700 нм) обрабатываются в группе фильтров. Для успешного внедрения этой технологии необходимы знания о том как использовать спектральное распределение поглощения и излучения флуоресцентных масс для выбора подходящего набора флуоресцентных микроскопических фильтров *.

Дихроскоп (или спектроскоп) является ключевым компонентом в комбинации флуоресцентных микроскопических фильтров, аналогичных длиннополосным интерферометрическим фильтрам, изготовленным из допусков к многослойным диэлектрическим материалам. Основное различие между дихроматоскопом и стандартным интерферометрическим фильтром заключается в том, что зеркало специально предназначено для отражения и пропускания на ограниченных длинах волн и должно работать под углом 45 градусов относительно световой оси микроскопа и светоизлучателя. Дихроскоп позиционируется как интерферометрическое покрытие, направленное на источник возбуждающего света, чтобы отражать короткие длины волн возбуждения от оптической системы к образцу под углом 90 градусов. Это же зеркало также должно действовать в качестве фильтра пропускания для передачи длинноволновой флуоресцентной эмиссии от объектива к плоскости изображения. Поскольку переходная область длины волны между почти полным отражением и большим пропусканием обычно ограничена 20 или 30 нм, дихроматоскопы могут точно различать длины волн возбуждения и излучения.

Комплект флуоресцентных фильтров предназначен для точного соответствия конкретного диапазона волн возбуждения отраженным областям в двухцветных зеркалах. В результате вспышки эффективно отражаются на образце через микроскоп. Флуоресцентная эмиссия образца должна соответствовать областям высокого пропускания в двухцветных зеркалах, чтобы эти длины волн могли проходить через детектор. Барьерные фильтры менее важны во всей программе, но по - прежнему играют важную роль в обеспечении устранения рассеянных и отраженных волн возбуждения, флуоресценции зондов вне цели и общей фоновой интенсивности, вызванной спонтанной флуоресценцией. Важным фактором при создании группы фильтров является обеспечение передачи, отражения, а кривая эмиссии соответствующего фильтра соответствует кривой эмиссии соответствующей области. В противном случае длина волны возбуждения может проходить через дихроматоскоп и размывать изображение, или флуоресцентная эмиссия может непреднамеренно отражаться в зеркале, чтобы повредить яркость изображения.

Даже в комбинации фильтров, которые кажутся идеально соответствующими, может произойти небольшое перекрытие спектрального распределения каждого фильтра, что снижает производительность. Особую озабоченность вызывает интерференция между возбуждающим фильтром и дихроматоскопом, которая позволяет некоторым вспышкам света отражаться через зеркало и от стенки блока фильтра. Как упоминалось выше, свет, отраженный под высоким углом наклона, может частично проходить через барьерный фильтр, чтобы уменьшить контрастность изображения. Эта утечка через фильтр называется инфильтрацией или пересечением на самом деле все комбинации фильтров происходят более или менее. Одним из основных направлений деятельности производителей фильтров и микроскопических компаний является улучшение конструкции комбинации флуоресцентных фильтров для снижения уровня пересечения.

Несколько конфигураций флуоресцентных фильтров показаны на рисунке 8. Башня вращения фильтра (рисунок 8 (a)) содержит пять блоков, которые могут быть быстро преобразованы между комбинациями фильтров, изучая по крайней мере это количество флуоресцентных скоплений. Одна из таких отверстий обычно заполнена виртуальными оптическими блоками или оставлена свободной для пропускания света. Используйте выравниватель возбуждения (рисунок 8 (b)) для тонкой настройки спектра возбуждения для получения изображений с двойной или множественной маркировкой образцов, содержащих отдельные интерферометрические фильтры, установленные на вращающихся разъемах. Регулирующий стержень балансировщика вращающегося возбуждения перемещает зону пропускания фильтра на более короткую длину волны. Таким образом, когда балансировочный фильтр вращается от угла падения с нуля (перпендикулярно оси вертикального освещения) до большого угла вращения 45 градусов, полоса пропускания фильтра может перемещать значения от 25 до 50 нанометров. Компрессоры возбуждения могут использоваться отдельно или последовательно для изменения наблюдаемой полосы возбуждения флуоресцентных красителей, чтобы интенсивность излучения была равной. Эта особенность позволяет точно настраивать интенсивность флуоресцентных масс в образцах, содержащих несколько зондов, например, уменьшая флуоресцентную эмиссию от одного зонда и увеличивая интенсивность другого. Компрессоры возбуждения могут использоваться отдельно или последовательно для изменения наблюдаемой полосы возбуждения флуоресцентных красителей, чтобы интенсивность излучения была равной. Эта особенность позволяет точно настраивать интенсивность флуоресцентных масс в образцах, содержащих несколько зондов, например, уменьшая флуоресцентную эмиссию от одного зонда и увеличивая интенсивность другого. Компрессоры возбуждения могут использоваться отдельно или последовательно для изменения наблюдаемой полосы возбуждения флуоресцентных красителей, чтобы интенсивность излучения была равной. Эта особенность позволяет точно настраивать интенсивность флуоресцентных масс в образцах, содержащих несколько зондов, например, уменьшая флуоресцентную эмиссию от одного зонда и увеличивая интенсивность другого.

Быстрое развитие технологии тонкопленочного покрытия может быть продемонстрировано способностью генерировать несколько пиков пропускания в одном интерферометрическом фильтре и создавать чередующиеся отражающие и пропускающие полосы в двухцветных зеркалах. При правильном согласовании два многодиапазонных и дихроматических фильтра могут быть объединены для создания нескольких наборов флуоресцентных фильтров, которые могут одновременно возбуждать и наблюдать излучение нескольких флуоресцентных групп. Группа фильтров может быть получена от изготовителя и подходит для двух, трех или даже четырех флуоресцентных скоплений в одном образце. Основная проблема с несколькими фильтрами - это их стоимость и избыточное пересечение или проникновение, когда излучение от одного флуоресцентного зонда проходит через другую полосу пропускания. В некоторых образцах (и группах фильтров) проникновение оказывает значительное влияние на интенсивность фона и контрастность изображения. Многие исследователи склонны использовать оптимизированные наборы фильтров для отображения каждого флуоресцентного скопления отдельно, а затем комбинировать изображение в комплекс.

Передовые флуоресцентные технологии обычно требуют использования нескольких возбуждающих и излучающих фильтров с одним дихроматоскопом. Для облегчения этих исследований многие флуоресцентные микроскопы оснащены электрическими светофильтрами или ползунками, которые содержат шесть отдельных фильтров (см. рис. 8 (c)). Микроскопы, предназначенные для ползунов, либо содержат специальные канавки для вставки ползунов в вертикальные светильники, либо ползунок фильтра может заменить ползунок, обычно содержащий фильтр нейтральной плотности. В некоторых микроскопических конструкциях вертикальные люминесценты также могут содержать излучающие ползунки или вспомогательные промежуточные трубки, установленные между светоизлучателем и наблюдательной трубкой для размещения ползунов. В вертикальных и перевернутых микроскопах элементы электрического фильтра, содержащие возбуждающий фильтр, обычно зажаты в оптическом канале вертикального освещения между фильтром нейтральной плотности и световой коробкой. Аналогичным образом, блок электроэмиссионного фильтра размещается между вертикальным осветительным прибором и окулярной наблюдательной трубкой в вертикальной микроскопической конструкции, но обычно соединяется с тем же внешним портом, что и детектор, используемый для инверсии устройства. Блоки возбуждения и передачи и электрические светофильтры очень полезны для применения двойного и тройного возбуждения с использованием отдельных двухцветных зеркал. Устранив необходимость переориентации фильтрующих блоков при наблюдении за отдельными образцами, эти аксессуары позволяют исследователям получить точную настройку между изображениями.

Объект флуоресцентного микроскопа

Во всех формах отражательной микроскопии (включая флуоресценцию) сила изображения является функцией числовой апертуры объектива и увеличения. На самом деле, интенсивность или яркость (определяемая как поток фотонов на единицу площади и времени) увеличивает квадрику числовой апертуры, но только обратно пропорциональна квадрату усиления:

Интенсивность α (NA obj) 4 / M 2

Среди них NA - числовая апертура объектива, а M - кратное увеличение. Из этой взаимосвязи ясно, что яркие флуоресцентные изображения будут состоять из высокихЧисленная апертураИ объективы с низкой степенью пропускания (например, 0,75 / 20x) собираются вместе. Например, 60x - спланированные антихроматические масляные объективы с численной апертурой 1,4 теоретически создают более яркие изображения, чем 100 - кратные объективы с такой же численной апертурой, но при этом необходимо учитывать компромисс. Увеличение количества элементов внутренней линзы (как и в случае с объективами с высокой апертурой) приводит к спонтанной флуоресценции и соответствующему увеличению отражения с внутренней поверхности линзы. Как правило, производители делают компромисс между положительными факторами в колледже и увеличенным световым пропусканием в своих рекомендуемых люминесцентных микроскопических зеркалах.

В целом, масло с высокой численной апертурой (1,3 - 1,4) и вода (1,2) погружаются в запланированные флюоресцентные и плоские антихроматические объективы, которые производят яркие флуоресцентные изображения из - за их огромной способности к конденсации. Эти объективы демонстрируют отличную цветовую коррекцию, что позволяет фокусировать несколько длин волн флуоресценции в одной плоскости. Характеристики спектроскопии и светопропускания флюоресцентных объективов являются * при низком уровне около 350 нм, что требуется для проверки флуоресцентных красителей, возбужденных в ультрафиолетовой области (например, DAPI, Hoechst, Alexa Fluor - 350 и AMC). Несмотря на множество внутренних объективов, эти объективы сделаны из низкофлуоресцентного стекла с антиотражающим покрытием, чтобы значительно уменьшить фоновую флуоресценцию и создать очень контрастные изображения.

Объекты, предназначенные для специальных применений, широко используются в флуоресцентных микроскопах. Эта категория включает в себя водяное погружение с высокой численной апертурой, многократное погружение (масло, вода и глицерин), а также ультрафиолетовые объективы с кварцевыми линзовыми элементами. Для применения визуализации живых клеток необходимы объективы с длинным рабочим расстоянием с корректирующими кольцами для наблюдения за образцами через стенки культивируемых бутылок толщиной (0,5 - 2 мм). Проверка толстых глубин образца облегчается с помощью объективов с очень длинным фокусным расстоянием (рабочим расстоянием), которые могут быть получены от нескольких производителей для визуализации через очки, покрытые воздухом или водой. Затопленные водой объективы с большим рабочим расстоянием, предназначенные для использования без покрытия, также имеют передний конус Teflon, поэтому объективы могут быть погружены в водный раствор. Аналогичные объективы создаются для ультрафиолетового возбуждения (340 нм) в воде на рабочем расстоянии от 20 до 30 мм (включая около 5 мм воды). Для исследований с относительно низким увеличением рекомендуется использовать 20 - кратные погруженные в воду объективы с * числовой апертурой (0,75 - 0,95). Хотя это очень дорого, эти объективы производят чрезвычайно яркие изображения при незначительной концентрации флуоресцентных масс и / или квантовой производительности.

Флуоресцентный микроскоп

Производители постоянно производят полезные дополнительные аксессуары для своих приборов, чтобы увеличить количество доступных вариантов для растущего применения изображений в флуоресцентной микроскопии. Например, на некоторых микроскопах можно выбрать диафрагму прямоугольного поля (см. рисунок 9), которая может ограничить область облученного образца, чтобы улучшить контраст и уменьшить отбеливание света. Модульные полевые диафрагмы заменяют традиционные диафрагмы диафрагмы диафрагмы (также съемные модули) в вертикальных осветительных приборах и предназначены для согласования соотношения сторон цифрового датчика изображения. Остановка прямоугольного поля повышает эффективность освещения Koller и снижает отношение сигнала к шуму электронных датчиков. В качестве дополнительного преимущества при использовании программируемой фазы сканирования в исследованиях обратной свертки размер прямоугольника изображения может быть скорректирован в соответствии с шагом фазы. Иглы напоминают диафрагму прямоугольного поля и могут использоваться в приложениях, требующих ограниченных по высоте осветительных полей.

Другие аксессуары включают двухламповый адаптер корпуса, который позволяет двум источникам света (например, ртутным и ксеноновым дуговым разрядным лампам) одновременно подключаться к вертикальному освещению. Световые приборы, подходящие для возбуждения лазеров, также могут использоваться для полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF), флуоресцентной визуализации жизни микроскопа (FLIM) и других применений, пропорциональной визуализации и экспериментов по восстановлению отбеливания света. Кроме того, большинство исследовательских флуоресцентных микроскопов, предлагаемых основными производителями, легко адаптируются к их соответствующим лазерным сканированиям с общей фокусировкой. Вертикальный микроскоп принимает конфокальные сканирующие блоки через трехглазую трубку наблюдения, в то время как инверторный прибор может подключить сканер луча к боковому или заднему порту микроскопической рамы. Двойной порт между вертикальным осветительным прибором и наблюдательной трубкой может быть использован для введения дополнительного источника света или направления флуоресценции к более чем одному детектору. Большинство из этих устройств оснащены дополнительным адаптером для установки типа C или стандартным микроскопическим портом.

Флуоресцентные микроскопы, предназначенные для электрофизиологических исследований, стали очень сложными. Многие из них оснащены специальными амортизационными ступенями, которые могут принимать различные аксессуары для микроманипуляций, используемые для экспериментов с флуоресцентным, инфракрасным дифференциальным интерферометрическим контрастом (IR - DIC) и традиционными методами визуализации контрастности открытого поля. Ротор маятника для животных обеспечивает быстрый обмен объективов без вибрации, чтобы предотвратить вторжение образцов или пузырьков при визуализации живых клеток и тканей. Новые микрообъективы с большой рабочей апертурой 2x и 4x (объективы) позволяют проводить флуоресцентные макроскопические наблюдения в живых организмах, оснащенных специальными фильтрующими блоками. Кроме того, некоторые производители предлагают флуоресцентные вертикальные осветительные приборы и наборы фильтров в качестве аксессуаров для своих стереомикроскопов.

Вертикальный светильник иногда может выбрать коэффициент усиления от 1,25 до 1,5 раза в качестве опции, но из - за присущей ему проблемы с введением воздушного усиления следует по возможности избегать использования вспомогательных объективов для входа в флуоресцентные изображения. Несколько модульных вертикальных осветительных приборов спроектированы таким образом, чтобы включать в себя устройства, соединяющие модули подсветки с несколькими портами камеры, расположенными над осветительными приборами, для увеличения мощности изображения. Учитывая широкий спектр электрических аксессуаров, доступных в настоящее время для флуоресцентной микроскопии, включая объективные роторы, конденсаторы, светофильтры и платформы, исследователи могут получить доступ к более сложным технологиям визуализации, чем когда - либо прежде. Производители вложили много усилий в дизайн аксессуаров для многих сложных флуоресцентных приложений, которые когда - то могли использовать только микроскопы из различных источников *. По мере того, как флуоресцентный микроскоп становится все более важным инструментом в области клеточной биологии, нейрофизиологии и клинической практики

Инвертированный флуоресцентный микроскоп

Аналогичные версии вертикальных люминесцентных осветительных приборов можно использовать для инвертирования (тканевой культуры) кронштейнов микроскопа. Перевернутый кронштейн также позволяет комбинировать или чередовать различные методы усиления контрастности между отражающим светом флуоресценцией и просвечивающим световым микроскопом. Научно - исследовательский инверторный микроскоп имеет несколько (более шести) портов ввода / вывода, как правило, с одним или двумя портами на каждой стороне рамы, а также один или два порта в задней части (верхний и нижний) и микроскоп нижнего порта в некоторых моделях, которые могут получать основное изображение от трех или более портов одновременно без использования ретрансляционного объектива. Этот уровень соединения позволяет проводить сложный флуоресцентный анализ с использованием нескольких источников света, светофильтрующих колец и систем камер. Ртутные и ксеноновые крышки для инвертированных микроскопов могут использоваться в сочетании со стандартными многоэлементными или асферическими конденсаторными линзами для повышения производительности и уменьшения аберрации в ультрафиолетовых и инфракрасных спектральных областях. Кроме того, для подключения нескольких источников освещения можно использовать различные адаптеры световых коробок, аналогичные тем, которые можно использовать для вертикальных микроскопов.

На рисунке 10 показан профиль современного инвертированного (тканевого культивирования) флуоресцентного микроскопа, оснащенного датчиком изображения CCD с охлаждением Peltier и традиционной 35 - мм фотокамерой. Несмотря на пленкукамераИспользование ограничено, но большинство перевернутых микроскопов все еще находятся в нижней части передней базы, включая порты, используемые для этих аксессуаров. Микроскоп, показанный на рисунке 10, может использовать вольфрамово - галогенные ламповые ящики, установленные на стойке, для выполнения традиционного освещения с открытым полем (с усилением контрастности или без него). Ртутные или ксеноновые дуговые разрядные лампы используются в флуоресцентных микроскопах с использованием отражателей света, подключенных к специально оборудованным задним портам. Аппендикулярные и полевые диафрагмы, а также фильтры нейтральной плотности входят вблизи порта в задней части микроскопа. В некоторых инвертированных микроскопических моделях (не показанных) L - образные светоотражатели, содержащие среднюю диафрагму, могут использоваться для улучшения доступа к заднему вспомогательному порту для дополнительных аксессуаров. На рисунке 10 световой путь через микроскоп обозначает пропускающий свет желтым, фиолетовый - нефильтрованным дуговым освещением, зеленый - фильтрованным флуоресцентным возбуждением, а красный - флуоресцентным излучением.

Современные обрамленные микроскопические рамки, как и их вертикальные аналоги, представляют собой композитные материалы, разработанные и изготовленные компьютером для структурной и тепловой устойчивости. Кроме того, компоненты механической платформы и конструкция схемы спроектированы с коротким расстоянием хода и высокой жесткостью, чтобы избежать тангажа и рыскания при управлении объективным рулевым устройством в обычных операциях, таких как вставка призмы DIC или настройка кольца коррекции объектива. Усовершенствованная фаза вращающегося диска объектива может фактически устранить дрейф фокуса во время длительных флуоресцентных наблюдений. Другие варианты сцены, которые стандартный вертикальный микроскоп не имеет, включают в себя скользящую и 360 - градусную вращающуюся сцену, стеклянную сценическую вставку, нагревательную пластину, чашку Петри и кронштейн пластины, а также инкубатор для культивирования углекислого газа.

Перевернутый микроскоп с модульной конструкцией может быть легко настроен для исследований в области электрофизиологии, экстракорпорального оплодотворения, микроопераций, DIC с высоким разрешением, видеонаблюдения и различных передовых методов флуоресценции. Эти приборы также легко подходят для конфокальной и многофотонной микроскопии. Электрические аксессуары включают жалюзи, светофильтры, роторы вращающихся объективов, роторы флуоресцентных блоков, фокусирующие приводы и конденсаторы. В сочетании с высококачественными объективами с высоким рабочим расстоянием, погружением в воду, ультрафиолетовым возбуждением и фазовым контрастом все они имеют высокую оптическую коррекцию, а инверторный микроскоп является идеальным инструментом для проведения флуоресцентных исследований живых клеток и тканей.

заключение

В флуоресцентном микроскопе широкое изменение концентрации локальных флуоресцентных масс в образце в сочетании с разницей в коэффициенте экстинкции и квантовой производительности от одного флуоресцентного красителя к другому значительно влияет на излучающий сигнал, создаваемый для количественной интенсивности возбуждения. Учитывая, что многие образцы содержат только небольшое количество флуоресцентных материалов в любом конкретном поле зрения, средний уровень флуоресцентной эмиссии, создаваемый этими комбинированными факторами, на 4 - 6 порядков меньше, чем интенсивность возбуждения. Кроме того, существуют более сложные флуоресцентные технологии, такие как гибридизация на месте и резонансный перенос энергии (FRET), которые излучают сигнал на 9 - 10 порядков меньше, чем возбужденный излучающий сигнал. Чтобы компенсировать эти большие различия между интенсивностью возбуждения и интенсивностью излучения, современные флуоресцентные микроскопы должны иметь возможность ослаблять возбуждающее излучение более миллиарда раз без помех флуоресцентным сигналам.

Одной из основных особенностей флуоресцентного микроскопа является высокая специфичность флуоресцентных зондов, которые поглощают и излучают свет на характерных длинах волн, что позволяет технологии избирательно обнаруживать виды объективов в сложных смесях при очень низких концентрациях. Кроме того, высокая чувствительность флуоресценции и пространственное разрешение позволяют точно определять и изучать отдельные молекулы в масштабе длины ниже оптического разрешения микроскопа. Локальные факторы окружающей среды также серьезно влияют на флуоресцентное излучение, поэтому метод является идеальным зондом для колебаний pH, вязкости, концентрации ионов, молекулярного расстояния и ориентации, мембранного потенциала, гидрофобности, распределения заряда и коэффициента диффузии. Временная разрешающая способность флуоресценции ограничена сроком службы возбужденного флуоресцентного зонда, который может быть наносекундным. Поскольку многие биологические процессы происходят в этой временной области, динамика распада может раскрыть динамическую информацию о клеточных процессах. В целом, эти факторы имеют решающее значение для применения флуоресцентной микроскопии в клеточной биологии.

За последнее десятилетие флуоресцентная микроскопия развивалась с угрожающей скоростью, в то же время быстро развиваясь в лазерных технологиях, твердотельных детекторах, производстве интерферометрических пленок и компьютерном анализе изображений. Разработка погруженных в воду объективов с высокой апертурой еще больше способствует изучению биологических явлений, позволяя исследователям глубоко исследовать живые клетки в их естественной среде. По мере того, как производители микроскопов реагируют на меняющиеся потребности исследовательского сообщества, разработка современных флуоресцентных приборов и аксессуаров, несомненно, будет продолжать развиваться, и их окончательный вклад в изучение природных тайн может в конечном итоге иметь далеко идущие последствия.