Флуоресцентный количественный PCR (qPCR) является основным оборудованием в области молекулярных биологических исследований, клинической диагностики (например, обнаружения нового коронавируса) и других областях, точность которого напрямую влияет на надежность результатов эксперимента. Корректировка (калибровка) является ключевым шагом в обеспечении стабильной работы qPCR - прибора и требует регулярной систематической проверки и настройки системы управления температурой (точность контроля температуры) и оптической системы (обнаружение флуоресцентных сигналов).
I. Основные цели коррекции
Корректировка qPCR предназначена для обеспечения соответствия следующих ключевых показателей производительности:
Система управления температурой: погрешность температурного индикатора (отклонение заданной температуры от фактической температуры), равномерность температуры (разность температур между отверстиями реакции), колебание температуры (изменение температуры со временем), максимальный температурный импульс (амплитуда превышения заданного значения в процессе нагрева / охлаждения), средняя скорость подъема и охлаждения (скорость нагрева / охлаждения).
Оптические системы: точность интенсивности флуоресценции (согласованность флуоресцентных сигналов в одном и том же отверстии), точность порогового цикла (величина Ct) (согласованность значений Ct в разных отверстиях), дрейф температуры плавления (величина Tm) (температурное отклонение при снижении интенсивности флуоресценции наполовину), коэффициент линейной корреляции флуоресценции (линейная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации нуклеиновой кислоты).
II. Подготовка к коррекции
1. Условия окружающей среды
Температура: 15–30 °C (чтобы избежать колебаний температуры, влияющих на результаты калибровки);
Относительная влажность: 20 - 85% RH (для предотвращения влажности прибора);
Источник питания: стабильное напряжение (рекомендуется использовать UPS), чтобы отключение электроэнергии не влияло на процесс калибровки.
2. Оборудование и материалы
Стандартное вещество: необходимо использовать сертифицированное стандартное вещество (например, плазмидную ДНК, стандартное вещество рибонуклеиновой кислоты), значение свойств которого (количество копий ≥10 ⁶copies / μL) и относительная неопределенность расширения (5%) должны соответствовать требованиям JJF (Zin) 04 - 2020;
Калибровочное оборудование: оптические симуляторы (интегрированные датчики температуры и генераторы излучающего света, диапазон измерения температуры 0 - 120°C, максимально допустимая ошибка ±0,1°C; длина волны излучающего света 360 - 780nm, регулируемая относительная интенсивность светового излучения), многоканальные термостаты (например, JDPC - 96, для измерения разности температур между отверстиями обратного напряжения);
Расходные материалы: Специальные калибровочные пластины (например, калибровочная пластина AB7500 ROI, фоновая калибровочная пластина), детекторы (2 мкл, 10 мкл и т. Д. Требуется метрологическая проверка), перчатки без порошка (калибровочная пластина для предотвращения загрязнения).
III. Основные процессы коррекции
Процесс коррекции прибора qPCR должен строго соответствовать JJF (Тяньцзинь) 04 - 2020 « Правила калибровки флуоресцентного количественного прибора PCR в реальном времени», в основном включает в себя калибровку температурной системы и калибровку оптической системы в двух частях, следующие инструменты серии AB7500 в качестве примера иллюстрируют конкретные шаги:
(i) Калибровка температурной системы
Температура является основным параметром реакции qPCR и напрямую влияет на эффективность амплификации ДНК. Калибровка температурной системы требует использования оптического симулятора (альтернативной реакторной трубки) для моделирования изменения температуры в реальной реакции и проверки температурного контроля прибора.
1. Подготовка к калибровке
Подключите оптический симулятор к прибору qPCR, чтобы убедиться, что датчик температуры ниже находится в хорошем контакте с источником флуоресцентного излучения выше и тепловым блоком прибора;
Нанесите теплопроводное масло под оптический симулятор, чтобы усилить теплопроводность;
Включите приборное программное обеспечение, выберите модуль "калибровки", войдите в программу "калибровки температуры".
2. Процедуры калибровки
Предварительное нагревание: установите температуру прибора 23°C, запустите процедуру подогрева (около 10 минут), чтобы прибор достиг стабильного состояния;
Настройка температурной точки: выберите 9 температурных точек (30°C, 50°C, 60°C, 70°C, 90°C, 95°C и т. Д.), каждая из которых длится 2 минуты (для измерения погрешности температурного индикатора, однородности, волатильности);
Процесс нагрева / охлаждения: от 50°C до 90°C (измеряется средняя скорость нагрева) и от 90°C до 50°C (измеряется средняя скорость охлаждения);
Сбор данных: прибор автоматически регистрирует заданную температуру (Ts), фактическую среднюю температуру (T₁₁₁₁), значения температурных колебаний (T v), максимальное значение избыточного импульса (T os) в каждой температурной точке.
3. Расчет результатов
Ошибка температурного индикатора: T = Ts - T₁ (требуется ± 0,5 °C);
Температурная однородность: Tu = T umax - T umin (T umax - максимальное значение температуры для всех отверстий, T umin - минимальное значение, требующее 1,0°C);
Колебания температуры: T v = ± (T max - T min) / 2 (T max - максимальное значение температуры для одного отверстия, T min - минимальное значение, требующее 0,2 °С);
Максимальный температурный избыточный импульс: T os = Tosmax - Ts (Tosmax является максимальным значением для всех отверстий с избыточным импульсом, требующим более 3,0°C);
Средняя скорость нагрева: v up = (TB - TA) / tut
Средняя скорость охлаждения: v down = (TB - TA) / tdo (tdo для времени охлаждения, требуется ≥3 °С / с).
(ii) Калибровка оптических систем
Оптическая система отвечает за обнаружение флуоресцентных сигналов, точность которых напрямую влияет на количественные результаты значений Ct и концентрации нуклеиновых кислот. Для калибровки оптической системы требуется специальная калибровочная панель (например, калибровочная панель AB7500 ROI), которая регулирует чувствительность флуоресцентного детектора в соответствии с сигналом.
1. Калибровка фона
Цель: устранение помех флуоресценции фона прибора (например, электронные сигналы, загрязнение пластиковыми расходными материалами);
Шаги:
(1) Удаление фоновой калибровочной пластины (необходимо поместить при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы избежать конденсата);
(2) Погрузить калибровочную пластину в прибор, запустить программу "фоновой калибровки" (около 30 минут);
(3) Программное обеспечение автоматически регистрирует фоновые флуоресцентные сигналы и генерирует файлы коррекции фона (автоматически вычитается в последующих экспериментах).
2. ROI (область интереса) Калибровка
Цель: отображать положение отверстия на реакционной пластине детектору прибора, чтобы обеспечить точный сбор флуоресцентных сигналов в каждом отверстии;
Шаги:
(1) Удаление калибровочной пластины ROI (стандартной или быстрой пластины, требующей вихря в течение 5 секунд и центрифугирования в течение 2 минут);
(2) Погрузить калибровочную пластину в прибор и запустить программу "ROI калибровки";
(3) Программное обеспечение автоматически фотографирует изображение каждого фильтра, создавая маску ROI (зеленый круг вокруг каждого отверстия, что указывает на успешную калибровку);
(4) Если изображение перенасыщено (слишком сильная флуоресценция в отверстии), время экспозиции должно быть скорректировано (например, уменьшено с 2048 до 1024) для повторного сбора изображения.
3. Оптическая калибровка
Цель: компенсировать физические эффекты оптических систем (например, спектральные реакции фильтров) для обеспечения точности флуоресцентных сигналов;
Шаги:
(1) Выберите программу "Оптическая калибровка" и загрузите файл калибровки ROI;
(2) Запуск программы (около 10 минут), программное обеспечение автоматически анализирует спектральные характеристики флуоресцентных сигналов, генерирует файлы оптической коррекции.
4. Калибровка красителей
Цель: проверить точность флуоресцентных сигналов различных красителей (например, FAM, VIC, ROX) для обеспечения надежности экспериментов с несколькими красителями;
Шаги:
(1) Удаление калибровочных панелей красителей (содержащих различные флуоресцентные красители, такие как CY3, CY5, FAM и т.д.);
(2) Погрузить калибровочную пластину в прибор и запустить программу "Калибровка красителя";
(3) Программное обеспечение автоматически собирает флуоресцентный спектр каждого красителя и генерирует файл коррекции красителя (сигнал красителя автоматически идентифицируется в последующих экспериментах).
(iii) Отчеты о результатах и сертификаты
После завершения калибровки необходимо выдать сертификат калибровки, сертифицированный CNAS и содержащий следующее:
(1) Основная информация прибора (модель, серийный номер, производитель);
(2) Калибровка условий окружающей среды (температура, влажность, время);
(3) Результаты калибровки (погрешность температурного индикатора, однородность, точность оптической системы и т.д.);
(4) Подпись калибровщика и аудитора;
(5) Квалификация калибровочного органа (номер аккредитации CNAS).
IV. ПРИМЕЧАНИЯ К КОРРЕКТИРОВАНИЮ
1. Калибровочный цикл
Рекомендуется проводить полную калибровку каждые 12 месяцев (в соответствии с требованиями JJF (Тяньцзинь) 04 - 2020);
При высоких частотах использования (например, при выполнении более 10 операций в день) или критических применениях (например, при клинической диагностике) их можно сократить до одного раза в 6 месяцев;
После перемещения прибора, ремонта или замены ключевых компонентов (например, нагревательных блоков, детекторов) требуется повторная калибровка.
2. Профессиональная поддержка
Калибровка должна осуществляться инженером - изготовителем или квалифицированным сторонним учреждением (например, Тяньцзиньским научно - исследовательским институтом метрологического надзора и тестирования) для обеспечения соответствия SOP (стандартные рабочие процедуры);
Неспециалистам запрещается самостоятельно регулировать параметры прибора (например, настройки температуры, оптические фильтры), чтобы не повлиять на результаты калибровки.
3. Проверка после калибровки
После завершения калибровки необходимо провести стандартный эксперимент по проверке вещества (например, стандартное вещество плазмидной ДНК) для обнаружения повторяемости значения Ct (коэффициент вариации 3%) и коэффициента линейной корреляции (R² ≥ 0,99) для обеспечения эффекта калибровки;
Если результаты проверки не соответствуют требованиям, необходимо повторно откалибровать или связаться с производителем для обслуживания.
V. Часто задаваемые вопросы и их решение
Температурная однородность не соответствует требованиям
Причины: гомогенное загрязнение (например, остаточные продукты PCR), старение датчиков температуры;
Решение: Очистить гомогенные блоки (протирать безводным этанолом), заменить датчик температуры.
Низкая интенсивность флуоресцентных сигналов
Причина: Ошибка калибровки ROI (ошибка отображения положения отверстия), высокая фоновая флуоресценция;
Решение: повторная калибровка ROI, запуск фоновой калибровки (замена фоновой калибровочной панели).
Велика вариация значений Ct
Причины: превышение температурных колебаний (например, нестабильность нагревательных блоков), снижение чувствительности флуоресцентных детекторов;
Решение: Проверьте температурную стабильность нагревательных блоков (измеряемую с помощью многоканального термометра), замените флуоресцентный детектор.
VI. РЕЗЮМЕ
Корректировка флуоресцентного количественного PCR является ключевым шагом на пути к обеспечению точности и надежности экспериментальных данных и требует строгого соблюдения отраслевых стандартов (например, JJF1527 - 2015, JJF (Zin) 04 - 2020), а также регулярной калибровки систем управления температурой и оптических систем. В процессе калибровки необходимо обратить внимание на условия окружающей среды, профессиональную поддержку и проверку результатов, чтобы убедиться, что производительность прибора соответствует экспериментальным требованиям. Благодаря стандартизированному процессу коррекции можно эффективно уменьшить погрешность эксперимента и повысить точность и повторяемость результатов qPCR.