Миф первый: чем больше каналов для приборов, тем лучше

С зрелым применением технологии PCR, многократное расширение становится все более оживленным, флуоресцентный количественный PCR не может быть спасен. От Zui Jun ABI запустила одноканальный флуоресцентный количественный PCR - прибор, разработанный до сегодняшнего дня, каждый производитель запускает 4 канала, 5 каналов и даже 6 каналов флуоресцентного количественного PCR - прибора, ослепительный выбор людей в растерянности, некоторые люди случайно вошли в недоразумение « чем больше каналов, тем лучше».

При использовании некоторых производителей 5 - канальных флуоресцентных количеств, чтобы гарантировать точность и точность результатов экспериментов с использованием ROX (флуоресцентный краситель) или Reference dye, эти флуоресцентные красители должны использовать отдельный канал обнаружения. Таким образом, есть только четыре эффективных канала, которые действительно могут обнаруживать множественные флуоресцентные сигналы PCR, и использование корректирующих красителей может увеличить затраты на более поздний период использования. Некоторые флуоресцентные количественные каналы обнаружения PCR открыты только для собственных производителей флуоресцентных красителей или реагентов, а эффективные каналы тестирования отнюдь не так много, как заявлено в рекламных материалах. Особенно важно перед покупкой подтвердить эффективный канал обнаружения флуоресцентных количественных приборов PCR и не просто слушать рекламу. При рассмотрении количества каналов многократного флуоресцентного количественного PCR также следует исходить из фактической ситуации в лаборатории, мульти - PCR не подходит для всех и доступен для всех, потому что он усложняет эксперимент.

Миф 2: Real - time PCR не требует градиента

Для количественных реакций PCR с использованием красителей, хотя существует множество программных средств для проектирования экстрактов PCR или эмпирических формул для расчета температуры плавления (значение Tm), используются разные формулы, последовательности экстрактов различны, значение Tm будет сильно различаться. Температура плавления экстракта определяет температуру отжига. Более того, комбинация оснований в шаблоне постоянно меняется, для специальных фрагментов данные, полученные эмпирической формулой, не обязательно дают точный результат, небольшие различия в температуре отжига могут оказать решающее влияние на результат, поэтому « прикосновение к условию» когда - то было головной болью. Появление градиента PCR частично решает некоторые проблемы - условия контроля температуры в каждом отверстии во время реакции могут меняться в диапазоне по градиенту, и в зависимости от результатов условия реакции могут быть изучены на одном шагу.

Не только температура отжига, но и температура дегенерации и удлинения могут быть оптимизированы - это важно для большинства высокоточных ферментов Taq, которые усиливаются несколькими полимеразными гибридами, такими как Invitrogen, Clontech и Promega, поскольку температура реакции Taq и корректирующего фермента может значительно различаться, поэтому важно оптимизировать температуру удлинения.

Использование градиентной функции флуоресцентного количественного PCR может за один раз завершить процесс оптимизации, который может быть завершен несколькими предыдущими экспериментами, упрощая громоздкие эксперименты по изучению условий реакции PCR, как для экономии времени эксперимента, так и для экономии затрат на эксперимент.