Патогенные бактериальные инфекции представляют серьезную угрозу для общественного здравоохранения, особенно в хронических и острых ранах, где локализация бактерий и образование биопленок затрудняют заживление ран. Терапия, основанная на активном кислороде (ROS), обладает преимуществами широкого спектра антимикробной активности и низкой резистентности и теперь стала неантибиотической стратегией для лечения инфекционных ран. Тем не менее, его клиническое применение по - прежнему ограничено такими проблемами, как низкая эффективность введения, плохая нацеленность бактерий и неконтролируемое воспаление после лечения.

С этой целью команда профессора Ли Вэй из Школы фармацевтики Уханьского университета разработала многофункциональный двухслойный пластырь для микроигл (LFT / S - MN), предназначенный для эффективной стерилизации и содействия заживлению ран. Пластырь связывает наночастицы на основе латекса (LFT NPS) с положительным зарядом с порфириновым акустическим сенсибилизатором (TAPPFe) и помещает их в растворимый базовый слой, одновременно загружая противовоспалительный препарат spermidine (SPD) в верхний слой иглы с pH - реакцией. Когда микроиглы вставляются в зараженную ткань, высвобождаемые LFT NPS могут эффективно нацеливаться и накапливать бактерии с отрицательным зарядом, генерируя большое количество ROS при ультразвуковой стимуляции с помощью синергии химической и акустической терапии (CDT / SDT). В то же время кислотная микросреда раны вызывает постепенное разложение игольчатого слоя, что приводит к контролируемому высвобождению SPD для иммуномодуляции. В модели раны мыши, зараженной латунно - зеленой псевдомоноцитозой (P. aeruginosa), пластырь LFT / S - MN значительно снижал бактериальную нагрузку, подавлял воспалительные реакции, способствовал осаждению коллагена и образованию новых кровеносных сосудов и ускорял закрытие раны.

Эта работа предлагает перспективную неантибиотическую стратегию для достижения противомикробной и регенерации тканей в ранах с помощью синергии CDT / SDT и воспалительной регуляции. Эта микроигла - пластырь использует технологию микростереолитографии (P - мкSL) с использованием прецизионной поверхности Морфана (microArch). ® S240， Точность: 10 мкм) 3D - печатная форма была переработана PDMS, результаты исследования опубликованы в журнале Journal of Controlled Release под названием « Three - in - one bilayer microneedle patch for ultrasound - activated antibacterial therapy and immune modulation in wound healing». Цзян Пэн, аспирант фармацевтического факультета Уханьского университета 2023 года, является автором диссертации, профессор Ли Вэй является автором диссертации, а фармацевтический факультет Уханьского университета является подразделением по завершению диссертации. Вышеупомянутая исследовательская работа поддерживается проектом Национального фонда естественных наук и PI Центра медицины жизни Тайкан Уханьского университета.

Как показано на рисунке 1, пластырь включает в себя положительно заряженные наночастицы латекса (LFT NP), связанные с порфириновым акустическим сенсибилизатором (TAPPFe), и верхний слой pH - реакции, нагруженный антивоспалительным веществом спермидином (SPD) в растворимом низовом уровне. После вставки в зараженную ткань высвобождаемый LFT NP эффективно нацеливается на бактерии с отрицательным зарядом и накапливает их, создавая мощные ROS при ультразвуковой стимуляции с помощью синергии химической динамики и акустической терапии (CDT / SDT). В то же время микросреда кислой раны вызывает постепенное разложение острого слоя, контролируемое высвобождение SPD для иммуномодуляции. В модели раны мыши, зараженной медно - зеленой псевдомоноцитарной инфекцией, пластырь LFT / S - MN значительно снижал бактериальную нагрузку, подавлял воспаление, способствовал осаждению коллагена и образованию новых кровеносных сосудов и ускорял закрытие раны.

Рисунок 1. Схема структуры и лечебного механизма пластырей LFT / S - MN для лечения инфекционных ран. (A) Двухэтажный пластырь LFT / S - MN спроектирован и подготовлен из растворимого базового слоя с положительным зарядом LFT NPS и пикового слоя pH - ответа для упаковки SPD. (b) После вставки инфекционной раны, базовый слой быстро растворяется и высвобождает LFT NPS, которые активно нацелены на бактерии с отрицательным зарядом и достигают эффективного удаления бактерий, производя ROS под US в сотрудничестве с SDT и CDT. В то же время, микросреда кислой раны вызывает деградацию острого слоя, что приводит к постоянному высвобождению SPD для регулирования воспаления. Эта совместная стратегия способствует бактериальной очистке, иммуномодуляции и регенерации тканей, что в конечном итоге ускоряет заживление ран.

Для достижения локализации и контроля высвобождения лекарств, используя стратегию последовательного формования, был подготовлен двухслойный пластырь MN с pH - реакцией, известный как пластырь LFT / S - MN. Для визуализации и структурной проверки два флуоресцентных зонда, белок сыворотки крупного рогатого скота (RhB - BSA) и флуоресцентный изотиоцианат (FITC), помеченные Rodanming B, были загружены в кончики наночастиц и нижние слои (рис. 2A и B) соответственно. Острый слой синтезируется ультрафиолетовой индуцированной полимеризацией свободных радикалов и скрещиванием шифа между полимером метакриловой кислоты (CSMA) и SPDTA, основание состоит из 18 Вт% поливинилового спирта (PVA) и раствора тростникового сахара, а задняя подложка состоит из 20 Вт% полистирола (PS). Анализ энергетической дисперсии рентгеновского спектра (EDS) (рисунок 2C) показывает, что железо из LFT NPS распределено равномерно, ограничено базовым слоем, а углеродные элементы в остром слое распределены равномерно, что указывает на явное пространственное разделение. Полученный пластырь LFT / S - MN состоит из массива 10×10 MN, охватывающего около 0,5 см2 (рис. 2D). Каждая игла имеет четкую коническую форму, высотой около 850 мкм, с очевидной двухслойной структурой (рис. 2E и F). Механические тесты показали, что сила разрушения каждой иглы составляет около 4N (рис. 2G), что достаточно для эффективной трансдермальной вставки и потенциального клинического применения.

Рисунок 2. Изображения плагинов LFT / S - MN. (A - B) Репрезентативное открытое поле и флуоресцентные изображения пластыря LFT / S - MN, иллюстрирующие структурную целостность и флуоресцентные маркеры легированных компонентов. (C) Энергетическая спектрограмма подтверждает распределение элементов внутри MNs. (D) Оптические изображения и (E, F) SEM изображения отображают форму LFT / S - MNs. Желтая пунктирная линия обозначает интерфейс между пиковым и растворимым слоями реакции ph. (G) Кривая силы - смещения LFT / S - MNs показывает, что ее механическая прочность подходит для проникновения кожи.

Для оценки проникающей способности кожи пластыря LFT / S - MN используется отдельная кожа свиньи. После применения MNs успешно прорвало роговой слой и доставляло упакованные флуоресцентные красители в кожу, что было показано флуоресцентным изображением (рисунок 3A), гистологическим подтверждением поперечного сечения (рисунок 3B). С помощью флуоресцентной микроскопии наблюдалось поведение растворения и последующее высвобождение LFT NPS. Как показано на рисунке 3C, первичный растворяется в PBS (pH 7.4) за 80 секунд, что способствует быстрому высвобождению LFT NPS из базы MN. Учитывая, что инфицирующая микросреда раны, как правило, кислая, авторы дополнительно изучили поведение pH - реакции кончика MN. Исследования экстракорпорального высвобождения показывают, что острый слой постепенно разлагается в условиях легкой кислотности (pH 5.6) и почти разлагается к 15 - му дню, в то время как в нейтральных условиях (pH 7.4) происходит минимальное разложение (рис. 3D), что указывает на кислотно - чувствительное поведение острого слоя. Количественное определение эффективности загрузки и доставки лекарственных средств (рис. 3E и F). LFT составляет 145,43 ±2,76 мкг, SPD - 14,96 ± 0,08 мкг. После введения через кожу доза LFT через MNs составляет 132,83 ± 2,91 мкг, а SPD через MNs - 14,38 ± 0,22 мкг, причем эффективность обоих препаратов превышает 90%. Кроме того, кумулятивное высвобождение SPD в кислых условиях (pH 5.6) достигло 88,87 ± 3,58% на 15 - й день, что значительно выше, чем PBS (pH 7.4), что еще раз подтверждает спектр высвобождения кислотной реакции на кончике MN (рис. 3G).

Рисунок 3. Оценка высвобождения лекарственных средств в пластыре LFT / S - MN. (A) Изображения репрезентативного яркого поля и флуоресцентной микроскопии кожи свиньи после имплантации пластыря LFT / S - MN. (B) Гистологический разрез кожи свиньи после имплантации пластыря MN. (C) Оптические изображения показывают быстрое растворение базового слоя и разделение острого слоя в PBS в течение 80 секунд. (D) Изображения инвертированной флуоресцентной микроскопии показывают разложение MN в течение 15 дней при различных pH условиях (pH 7.4 и 5.6), имитируя нейтральную и легкую кислую рану. (E) Количественная оценка загрузки и доставки LFT пластырями LFT / S - MN. (F) Количественная загрузка и доставка SPD - плагинов LFT / S - MN. (G) кривая кумулятивного высвобождения SPD во времени в LFT / S - MNs. Данные представлены в виде meant ± SD (n = 3 отдельных выборки).

Авторы систематически оценивали антимикробные эффекты пластырей LFT / S - MN in vitro. Как показано на рисунке 4D, минимальная ингибирующая концентрация LFT (MIC) при ультразвуковом облучении (3 МГц, 0,97 W / cm2, 50 - процентное отношение пустоты, 30 мин) составляет 128 мкг / мл. Отдельные пластыри LFT / S - MN демонстрируют умеренную антибактериальную активность с ингибированием 36,41 ± 0,75% для золотистого стафилококка и 35,87 ± 1,48% для латунно - зеленого псевдомоноцита (рис. 4A и E). Для сравнения, после активации ультразвука скорость депрессации пластыря LFT / S - MN значительно улучшилась и составила 99,95 ± 0,04% и 99,96 ± 0,04% соответственно (рисунок 4E), что указывает на почти инактивацию бактерий. Эти результаты были дополнительно подтверждены окрашиванием SYTO 9 / PI, где группа LFT / S - MN US показала преобладающую красную флуоресценцию, указывающую на широкую гибель бактерий (рис. 4B и F). Сканирующие зеркала (SEM) предоставляют дополнительные морфологические доказательства; Бактерии в необработанной группе сохраняли полную и гладкую мембрану, в то время как бактерии, подвергшиеся воздействию ультразвуковой активации LFT / S - MN, демонстрировали значительные структурные нарушения и разрыв мембраны (рисунок 4C). В целом, эти результаты подтверждают, что после ультразвуковой активации пластырь LFT / S - MN может производить большое количество локальных ROS, которые эффективно уничтожают бактерии в пораженном месте.

Рисунок 4. Исследование антимикробных свойств пластырей LFT / S - MN in vitro. (A) Репрезентативные фотографии листа агара, показывающие антибактериальный эффект LFT / S - MNs на золотисто - желтый стафилококк и медно - зеленый псевдомоноцит. (B) Изображения с помощью флуоресцентного микроскопа показывают, что золотисто - желтый стафилококк и медно - зеленые псевдоодноклеточные бактерии вызывают окислительный стресс, вызванный ROS, при различных условиях обработки. (c) Обработка SEM - изображений после бактериальной формы, показывающих разрушение мембран и структурную деформацию золотисто - желтого стафилококка и медно - зеленого псевдомоноцита. (D) Минимальная ингибирующая концентрация LFT против золотистого стафилококка (MIC) в LFT / S - MNs показывает дозозависимую антибактериальную активность. Красная стрелка обозначает MIC - значение LFT. (Е) Количественный анализ активности бактерий после различной обработки с помощью оценки живого / мертвого окрашивания. (F) Результаты соответствующих измерений интенсивности зеленой флуоресценции (FI) в живых / мертвых экспериментах еще раз подтверждают антибактериальное действие. Данные отображаются в виде meant ± SD (n = 3 отдельных выборки). ** p < 0.01，** p < 0.001，**** p < 0.0001。 NS означает отсутствие существенности.

Чтобы проверить терапевтический эффект пластыря LFT / S - MN в организме, авторы использовали медно - зеленые псевдомоноциты (П. аэрuginosaСоздание модели раневой инфекции кожи у мышей (рисунок 5А). Зараженные мыши были случайным образом разделены на восемь групп (каждая группа n = 5), в том числе группы без ультразвука (Blank, S - MN, LF / S - MN, LFT / S - MN) и группы ультразвуковой обработки (Blank + US, S - MN + US, LF / S - MN + US, LFT / S - MN + US). Ультразвуковая схема включает в себя ежедневное облучение 3 МГц, 0,97 W / cm2, 50 - процентное отношение пустоты, 30 минут, 3 дня подряд. На 0, 1, 3, 5 и 9 - й день после лечения наблюдалось прогрессирование раны путем фотографирования (рисунок 5B). На 1 - й день септическое просачивание в группе LFT / S - MN + US значительно сократилось, что отражает комбинированное антибактериальное действие CDT и SDT. Напротив, неультразвуковые группы показали более широкий сепсис и воспаление. На 3 - й день, после завершения ультразвукового введения, были собраны образцы раневого слоя для бактериальной культуры, оценена остаточная бактериальная нагрузка (рис. 5Е). Количество планшетов показывает, что колонии группы LFT / S - MN + US сформировались наименее, что указывает на более высокую антимикробную активность в их организме (рис. 5F). К 9 - му дню уровень заживления ран у мышей, обработанных LFT / S - MN + US, был высоким, и была заметна регенерация тканей (рисунок 5C). Мониторинг веса на протяжении всего лечения не выявил значительных колебаний между группами (рисунок 5D), что указывает на хорошую биологическую совместимость пластырей MN по всему телу. Подводя итог, эти результаты показывают, что LFT / S - MN в сочетании с ультразвуком эффективно устраняет бактериальные инфекции и значительно ускоряет заживление ран в организме.

Рисунок 5. Антибактериальный эффект в организме и целебные свойства пластырей LFT / S - MN. (A) Схема модели раны у мышей, инфицированных псевдомоноцитами медно - зеленого цвета, и стратегия лечения с использованием пластыря MN плюс или без стимуляции US. (В) Репрезентативные фотографии частей раны на 0, 1, 3, 5 и 9 день после обработки. Черный пунктирный круг обозначает начальную границу раны. (С) Количественный анализ заживления ран в каждой группе лечения с течением времени (n = 5). (D) Мониторинг веса мышей во время лечения (n = 5). (E) фотографии агаровой пластины, выращенной бактериальными колониями в раневом слое на 3 - й день каждой группы. (F) Количественное определение активности бактерий на основе анализа единицы образования колоний (CFU) (n = 3). Данные представлены в виде подразумеваемого ±SD. *** p < 0.001，**** p < 0.0001。 NS означает отсутствие существенности.

Выводы:Исследование успешно разработало двухслойный микроиглоукалывающий пластырь с pH - реакцией (LFT / S - MN), который обеспечивает эффективное лечение инфекционных ран, интегрируя синергическую антибактериальную терапию (CDT / SDT), активированную ультразвуком, с иммунной регуляцией, вызванной кислой микросредой. Пластырь не только быстро высвобождает LFT NPS, нацеленные на бактерии, генерируя большое количество ROS под ультразвуком, чтобы очистить бактериальные и биологические мембраны, но и постоянно высвобождает SPD в кислых условиях раны, регулируя поляризацию макрофагов и подавляя чрезмерное воспаление. Эксперименты в организме подтвердили, что стратегия значительно ускоряет закрытие ран, способствует регенерации тканей и обладает отличной биологической безопасностью. Эта работа предлагает новую стратегию с потенциалом клинической трансформации для лечения ран инфекций и регенерации тканей, не зависящих от антибиотиков.