Резюме

Технология электрического преобразования сетчатки глаза новорожденных мышей обеспечивает ключевые средства для развития сетчатки и исследований заболеваний. Исследования с помощью электроперфоратора Wineid Gene Pulser 830 квадратного типа оптимизируют параметры электрического преобразования, обеспечивают эффективную доставку и экспрессию экзогенных генов в сетчатке новорожденных мышей, значительно повышают эффективность транскрипции и обеспечивают надежную техническую платформу для фундаментальных исследований, связанных с сетчаткой, и конверсионной медицины.

Введение

Как ключевая организация для передачи визуальных сигналов, изучение механизмов развития и механизмов возникновения заболеваний всегда было горячей точкой в области офтальмологии. Ретины новорожденных мышей находятся в стадии быстрого развития, когда генетические операции могут эффективно изучать роль генов в дифференциации, миграции и функциональном построении клеток сетчатки. Тем не менее, традиционные методы доставки генов имеют проблемы с низкой эффективностью и большим повреждением клеток в работе живой сетчатки глаза, что затрудняет удовлетворение потребностей точных научных исследований.

Технология электрического преобразования мгновенно изменяет проницаемость клеточной мембраны через импульсное электрическое поле, позволяя крупным молекулам, таким как экзогенные нуклеиновые кислоты, входить в клетку и демонстрировать преимущества в передаче генов живых тканей. Благодаря своей передовой технологии квадратных импульсов, интеллектуальным системам мониторинга и гибким параметрам, электроперфоратор Wineid Gene Pulser 830 обеспечивает высокоэффективное и точное решение для преобразования живого тела сетчатки глаза новорожденных мышей, помогая исследователям преодолеть узкие места в традиционных технологиях.

Материалы и методы

1.Экспериментальные животные

Новорожденные мыши C57BL / 6J через 0 - 2 дня после рождения (P0 - P2), обеспечиваемые комнатой для животных класса SPF в этой лаборатории, кормят температуру окружающей среды (22 ± 2) °C, влажность 50% - 60%, 12 небольших временных световых / темных циклов.

2. Основные реактивы

плазмидная ДНК (содержащая ген назначения GFP, сконструированный этой лабораторией), реагент (используемый для приготовления электротрансбуферного раствора, содержащего NaCl, KCl, глюкозу и другие компоненты, pH до 7,4), анестетик (изофторан, используемый для анестезии мышей), дезинфицирующий реагент (75% этанол).

3. Основные приборы

Квадратный перфоратор Wined Gene Pulser 830, стереоскопический микроскоп (бренд, для хирургического наблюдения), микроинъекционная игла (внешний диаметр 10 - 15 мкм для инъекции плазмиды), термостатическая панель (для поддержания температуры тела мышей).

Экспериментальные шаги

1. Анестезия и фиксация мышей

Новорожденных мышей помещают в анестезионную коробку, содержащую изофторэн, вызывая анестезию и перенося на термостат для поддержания стабильной температуры тела. Используйте ленту, чтобы аккуратно закрепить голову и конечности мыши, чтобы обеспечить стабильную позицию мыши во время операции.

2. Локализация сетчатки и инъекции плазмиды

Под соматическим микроскопом плазмидная ДНК, содержащая ген назначения (концентрация 1 - 2 мкг / мкл), извлекается из микроскопической иглы, вводится из края височной роговицы глазного яблока мыши, медленно вставляется кончик иглы в стеклянную полость, избегая хрусталика, и точно вводится 5 - 10 мкл плазмидного раствора в нижнюю полость сетчатки. Во время инъекции обратите внимание на контроль глубины и скорости инъекции, чтобы избежать повреждения сетчатки.

Настройка и эксплуатация параметров электрической перфорации

Квадратный перфоратор Wineid Gene Pulser 830 использует предварительно запрограммированную оптимизированную систему, для характеристик ткани сетчатки новорожденных мышей, выбирает режим транскрипции клеток млекопитающих, вызывает встроенные рекомендуемые параметры клеток сетчатки: квадратные импульсы, напряжение в соответствии с возрастом мыши и размером глазного яблока (обычно 50 - 80В), длительность импульса 10 - 20мс, количество импульсов 3 - 5, интервал импульсов 1 - 2s.

Настройка электрода типа пинцета (интервал между электродами 1 - 2 мм, поверхность изолирована, чтобы избежать утечки тока) мягко зажимает глазное яблоко мыши, гарантируя, что электрод плотно прилегает к поверхности глазного яблока и не давит глазное яблоко. Запуск программы перфорации с помощью педального переключателя, 10 - дюймовый сенсорный экран прибора в режиме реального времени отображает импульсную форму волны и динамику параметров, чтобы экспериментаторы могли контролировать весь процесс. Во время электроперфорации прибор автоматически проводит интеллектуальное обнаружение сопротивления, предварительный импульс измеряет сопротивление образца, динамически регулирует параметры, чтобы убедиться, что условия каждого удара соответствуют состоянию клеток сетчатки. В то же время технология дуговой защиты и полярного преобразования устраняет повреждение дуги, преодолевает барьер заряда клеточной мембраны и повышает успешность труднотрансформируемых клеток.

4. Послеоперационная обработка

После завершения операции электрического перехода мышь перемещается обратно к мыши, сохраняя окружающую среду теплой и спокойной. Ежедневное наблюдение за состоянием глаз и выживаемостью мышей после операции гарантирует отсутствие инфекций и других осложнений.

Итоги и обсуждения

Анализ эффективности транскрипции

Через 3 дня после электрического поворота берутся глазные яблоки мышей, готовятся замерзшие срезы сетчатки, а через флуоресцентную микроскопию наблюдаются проявления зеленого флуоресцентного белка (GFP). Результаты показали, что видимые флуоресцентные сигналы GFP были видны на всех слоях сетчатки, особенно на клеточном уровне ганглий, внутреннем и внешнем ядрах, а эффективность транскрипции была более чем на 40% выше, чем при традиционных методах (на основе данных внутренних тестов Wineid). Это стало возможным благодаря высокоинтенсивному электрическому полю электроперфоратора Wineid Gene Pulser 830, который мгновенно изменил проницаемость клеточной мембраны и обеспечил эффективную доставку макромолекул нуклеиновой кислоты.

Выживание клеток и оценка повреждений тканей

Наблюдение за структурой ткани сетчатки с помощью крашения сульфин - ирон (HE), электрическая группа мышей сетчатки глаза имеет четкую структуру слоев, клетки расположены аккуратно, по сравнению с контрольной группой, не было выраженного некроза клеток или воспалительных реакций. Эксперимент по отторжению Taiban Blue показал, что выживаемость клеток сетчатки после электрического перехода составляет более 90%, что указывает на то, что технология электрического преобразования имеет небольшое повреждение ткани сетчатки глаза, что обеспечивает возможность последующих экспериментов.

Преимущества по сравнению с традиционными технологиями

Традиционные методы транскрипции вирусных векторов имеют такие проблемы, как длительный цикл подготовки, высокая стоимость, ограниченная пропускная способность носителя и могут вызвать иммунный ответ. С другой стороны, технология живого электрического преобразования, проводимая с помощью электроперфоратора Wineid Gene Pulser 830 с квадратной волной, может доставлять большие молекулы, такие как ДНК, РНК и белки, без вирусной упаковки, легко и быстро, с низкой стоимостью, избегая при этом потенциальных рисков для вирусных векторов. Его полноволновая интеллектуальная система мониторинга обеспечивает прозрачный и контролируемый экспериментальный процесс, данные отслеживаются, чтобы помочь точному воспроизведению результатов научных исследований. Система предварительно запрограммированной оптимизации встроена в общую базу параметров клеточного штамма, вызов одним щелчком мыши, в то же время поддерживая пользовательские импульсные параметры, адаптируясь к сетчатке новорожденных мышей и другим сложным сценариям, демонстрируя большую гибкость и применимость.

Технологическая оптимизация и внимание

В ходе эксперимента было обнаружено, что оптимизация параметров электрической перфорации является ключевым фактором, влияющим на эффективность транскрипции. Слишком высокое напряжение или слишком много импульсов могут привести к повреждению клеток, в то время как слишком низкое напряжение недостаточно эффективно транскрипции. Интеллектуальная функция обнаружения сопротивления Winide Gene Pulser 830 позволяет эффективно решать эту проблему, корректируя параметры в соответствии с динамическим сопротивлением образца. Кроме того, концентрация и объем инъекционных плазмид, степень прилипания электродов и возраст мышей влияют на результаты эксперимента и требуют строгого контроля за условиями эксперимента.

Перспективы применения

Области фундаментальных исследований

Эта технология может широко использоваться в функциональных исследованиях генов, связанных с развитием сетчатки глаза, таких как технология редактирования генов CRISPR в сочетании с электрическим преобразованием, которая может достигать выбивания или постукивания специфических генов сетчатки глаза и изучать их роль в дифференциации клеток сетчатки и формировании нейронных цепей; Передача siRNA может быть использована для подавления экспрессии целевых генов и изучения механизмов генов при заболеваниях сетчатки глаза; В исследованиях по перепрограммированию стволовых клеток технология электрического преобразования может эффективно импортировать факторы перепрограммирования в стволовые клетки сетчатки, предлагая новые способы регенеративных медицинских исследований сетчатки.

Трансформационной медицины.

Что касается электрической трансмиссии живых опухолей, то они могут быть нацелены на опухоли глаз, такие как ретинобластома, и передавать терапевтические гены или лекарства посредством электрического преобразования для достижения точного целевого лечения; При разработке вакцины технология электрической трансформации может доставлять антигены в иммунные клетки, связанные с сетчаткой глаза, индуцировать иммунный ответ и предоставлять новые идеи для исследований глазной вакцины; Что касается генной терапии в организме, то для наследственных заболеваний сетчатки глаза, таких как пигментный ретиноит, врожденная меланомия и т. Д., Технология электрического преобразования может импортировать нормальные гены в клетки сетчатки, чтобы заложить основу для клинического применения генной терапии.

Сельское хозяйство и промышленность

В то время как исследования были сосредоточены на сетчатке глаза новорожденных мышей, широкая применимость квадравлического перфоратора Wineid Gene Pulser 830 также открывает большие возможности в сельском хозяйстве и промышленности. В генетических улучшениях растений, которые могут быть использованы для доставки генов протоплазмы растений, ускоряют улучшение сортов сельскохозяйственных культур; В строительстве дрожжевой инженерии и микробиологической метаболической инженерии технология электрического преобразования может эффективно реализовать импорт чужеродных генов и повысить эффективность производства инженерных бактерий.

Квадратный перфоратор Wined Gene Pulser 830 благодаря инновационной технологии квадратных импульсов, интеллектуальным системам мониторинга и глубинным техническим услугам стал надежным выбором для более чем 500 ведущих научно - исследовательских институтов. Будь то точные генетические операции в фундаментальных исследованиях или инновационные терапевтические исследования в конверсионной медицине, устройство обеспечивает эффективную и надежную технологическую платформу для исследователей. В настоящее время Wineid предоставляет бесплатные консультации по техническим программам и услуги по испытанию продуктов, чтобы помочь исследователям преодолеть технические барьеры транскрипции и содействовать исследованиям в области наук о жизни и смежных областях.

Список литературы

1. Изменения в экспрессии генов, связанных с ангиогенезом и кислородным стрессом, при ретинопатии новорожденных мышей, вызванных кислородом [J]. Юйцзэн Ян, Гун Чэньюань, Чжан Гоцин. Циркуляр китайской фармакологии. 2014, № 010

2.Моноклеточный хемопротеин - 1 экспрессируется в моделях новорожденных мышей с индуцированной кислородом ретинопатией [J]. Dong Ning, Chu Li, Xiao Lin. Китайский экспериментальный офтальмологический журнал. 2012, № 004

3. Выражение мононуклеотидного хемопротеина - 1 в моделях новорожденных мышей с индуцированной кислородом ретинопатией [J]. Донг Нин, Чу Лицюнь, Сяо Линь. Китайский экспериментальный журнал офтальмологии. 2012, № 004

4. Изменение экспрессии и значение MCP - 1 в тканях сетчатки глаза новорожденных мышей [J]. Донг Нин, Чу Лицюнь, Сяо Линь. Шаньдунская медицина. 2011, № 026

5.MMP - 2 экспрессия в модели новорожденных мышей с ретинопатией недоношенных детей [J]. Цзян Шуан, Чэнь Сяолун. Журнал Ляонинского медицинского института. 2009, № 006