Молекулярные гибридисты являются основным оборудованием для молекулярных биологических исследований, используемых для обнаружения нуклеиновых кислот (DNA / RNA) или белков, и широко используются в анализе экспрессии генов, обнаружении мутаций и других областях. Его операции должны строго соответствовать стандартизированному процессу для обеспечения точности эксперимента. Вот полный процесс использования и ключевые моменты:

I. Подготовка к эксперименту

1. Подготовка образцов и зондов

- извлечение целевых нуклеиновых кислот (например, геномной ДНК, мРНК) в экспериментальных целях и их перенос в твердофазные поддерживающие вещества (нейлоновые мембраны / мембраны ПВДФ) путем ферментации, электрофореза и разделения.

- Маркировочный зонд: Специфический олигонуклеотидный зонд, маркированный изотопом (м² P), флуоресцентным красителем или биотином, требует проверки чистоты и концентрации зонда.

2. Проверка приборов

- Убедитесь, что система терморегулирования гибрида в норме, работа качающегося станка стабильна, герметичная пленка не повреждена старением.

- Предварительное подогревание прибора до заданной температуры (обычно 42 - 65°C, в зависимости от типа зонда), уменьшает влияние колебаний температуры на эффективность скрещивания.

3. Конфигурация реагентов

- Приготовьте предварительно гибридные жидкости (содержащие герметики, такие как ДНК лосося, SDS и т.д.), гибридные жидкости и градиентные растворы для очистки соли, обратите внимание на фильтрацию и стерилизацию во избежание загрязнения.

II. Основные оперативные шаги

1. Предварительная гибридизация

- Поместите мембрану, фиксирующую нуклеиновую кислоту, подлежащую измерению, в гибридную трубку, добавьте достаточное количество прегибридной жидкости, погруженной в мембрану, и вылупите при заданной температуре в течение 1 - 2 часов. Этот шаг направлен на то, чтобы закрыть неспецифические места связывания на мембране и уменьшить фоновый шум.

- * Ключевой контроль *: Поддержание небольших колебаний способствует циркуляции жидкости, избегая образования пузырьков.

2. Гибридные реакции

- Выбросить прегибридную жидкость, непосредственно добавить гибридную жидкость с маркированным зондом (конечная концентрация зонда обычно составляет 1 - 10 нг / мл) и продолжить инкубацию с умеренными колебаниями на ночь (8 - 16 часов).

- * Стратегия оптимизации *: температура гибридизации = Tm значение - 5°C (Tm для температуры цепи зондового решения), с учетом специфичности и чувствительности.

3. Классификация мембран

- Промывка методом последовательной регрессивной концентрации соли (например, последовательное использование 2×SSC → 0.5×SSC → 0.1×SSC), постепенное удаление несвязанных или неправильных зондов.

- Методы работы *: Перед каждым обменом жидкости высасывается остаточная жидкость, и промывка с высокой степенью строгости улучшает специфичность, но чрезмерная промывка может привести к потере реального сигнала.

Обнаружение сигналов и анализ данных

1. Сбор изображений

- Выбор соответствующего способа обнаружения в соответствии с типом маркировки зонда: радиоактивное самовыражение требует прижимных рентгеновских снимков; Химическая люминесценция с использованием CCD - визуализатора; Флуоресцентные зонды могут сканировать напрямую.

- * Управление экспозицией *: отрегулируйте время экспозиции, чтобы избежать насыщения, синхронизируйте настройки пустого контроля, чтобы исключить фоновые помехи.

2. Толкование результатов

- Количественный анализ с использованием программного обеспечения ImageJ для расчета значений серой полосы и полуколичественной оценки уровня экспрессии генов; Качественный анализ фокусируется на согласовании положения полосы с ожидаемой молекулярной массой.

- * Аномальная обработка *: В случае появления неспецифической полосы требуется переориентация конструкции зонда или повышение точности промывки.

IV. Обработка и техническое обслуживание

1. Удаление отходов

- Изотопные отходы обрабатываются в соответствии с нормами обращения с радиоактивными отходами, а флуоресцентные / химически люминесцентные реагенты рекуперируются в специальные контейнеры.

2. Техническое обслуживание приборов

- Очистить жидкость в гибридной трубке, после промывки водой 70% этанола пропитать и дезинфицировать, регулярно откалибровать датчик температуры.

- Запишите параметры этого эксперимента (температура, скорость, время) в журнал устройства для последующего эксперимента для справки.

Работа молекулярного гибридизатора требует точного контроля температуры, времени и растворной среды, и любое отклонение может привести к ложноположительному / ложноотрицательному результату. Первоначальным пользователям рекомендуется проводить параллельные контрольные эксперименты и определять оптимальные условия гибридизации с помощью предварительных экспериментов. Стандартизированная операция в сочетании со строгими мерами контроля качества может гарантировать надежность результатов эксперимента.