Набор реагентов CCK - 8 (клеточная пролиферация и токсикология)

Набор реагентов Cell Counting Kit - 8, сокращенно CCK - 8, является альтернативой методу MTT и представляет собой набор быстродействующих высокочувствительных детекторов, основанный на WST (водорастворимая тетразоловая соль, химическое название: 2 - (2 - метоксид - 4 - нитрофенил) - 3 - (4 - нитрофенил) - 5 - (2,4 - дисульфонилбензол) - 2H - тетразолмононатриевая соль), которая широко используется для клеточной пролиферации и клеточной токсичности. Может использоваться для скрининга лекарств, клеточной пролиферации, цитотоксики, онкофармакологической чувствительности и других испытаний.

Описание использования:
Изготовление стандартных кривых (при определении конкретного количества клеток)
Количество клеток в подготовленной клеточной суспензии исчисляется с помощью клеточной счетной пластины, а затем вводится клетка.
2, пропорционально и последовательно разбавляется в градиент клеточной концентрации с равным отношением питательной среды, обычно делается 3 - 5 градиентов клеточной концентрации, каждая группа 3 - 6 комплексных отверстий.
3. После вакцинации культивируется до клеточной стенки, а затем добавляется реагент CCK - 8 для культивирования определенного времени после измерения значения OD, чтобы сделать стандартную кривую с количеством клеток в качестве горизонтальных координат (ось X), а значение OD в качестве вертикальных координат (ось Y). На основе этой стандартной кривой можно определить количество клеток в неизвестном образце (пробная версия этой стандартной кривой предполагает, что условия эксперимента будут одинаковыми, что облегчит определение количества прививок клеток и времени культивирования после добавления CCK - 8. )

II. Тестирование активности клеток

Прививка клеточной суспензии (100 мкл / отверстие) в пластине 96 отверстий. Поместите питательную пластину в инкубатор для предварительной культивации (при 37°C, 5% CO2).

В каждое отверстие добавляется 10 мкл раствора CCK - 8 (обратите внимание, что в отверстии не образуются пузырьки, которые влияют на показания OD).

3. инкубация питательной пластины в инкубаторе в течение 1 - 4 часов.

При помощи энзимометра измеряется абсорбция на 450 нм.

Если значение OD временно не измеряется, то для последующего измерения в каждое отверстие может быть добавлен раствор HCl или 1% SDS (W / V) размером 10 мкл 0,1 м, а экран для защиты от света хранится при комнатной температуре. В течение 24 часов светопоглощение не меняется.

III. Клеточная добавленная стоимость - обнаружение токсичности

Настройка 100 мкл клеточной суспензии в 96 - пористой пластине. Культурную пластину предварительно культивируют в инкубаторе в течение 24 часов (при 37°C, 5% CO2).

Добавление в культурную плиту 10 мкл вещества, подлежащего измерению в различных концентрациях. Подходящий период инкубации в инкубаторе (например: 6, 12, 24 или 48 часов).

Добавляйте 10 мкл раствора CCK - 8 в каждое отверстие (обратите внимание, что пузырьки не образуются в отверстии, они влияют на показания OD). Если вещество, подлежащее измерению, обладает окислительной или восстановительной способностью, свежую питательную среду можно заменить перед добавлением CCK - 8 (удалить питательную среду и дважды промыть клетку питательной средой, а затем добавить новую среду), устранив лекарственное воздействие.

4. инкубация питательной пластины в инкубаторе в течение 1 - 4 часов.

Абсорбция на 450 нм измеряется с помощью энзимометра.

Если значение OD временно не измеряется и предполагается измерить позже, то в каждое отверстие может быть добавлен раствор HCl или 1% SDS (W / V) объемом 10 мкл 0,1 м, а защитная панель хранится при комнатной температуре. В течение 24 часов светопоглощение не меняется.

Динамический расчет:...

Клеточная жизнеспособность (%) = [A (добавка) - A (пустота)] / [A (0 добавка) - A (пустота) x 100

А (дозировка): поглощение света отверстиями с клетками, раствором CCK - 8 и фармацевтическим раствором

A (пустота): поглощение отверстий с питательной средой и раствором CCK - 8 без клеток

A (0 добавок): поглощение света в отверстиях с клетками, раствором CCK - 8 без фармацевтического раствора

Клеточная жизнеспособность: клеточная или цитотоксическая жизнеспособность

Внимание:

Рекомендуется сначала сделать несколько отверстий, чтобы выяснить количество вакцинированных клеток и время культивирования после добавления реагента CCK - 8.

Белые кровяные клетки могут быть культивированы в течение более длительного периода времени.

При использовании стандартной 96 - дырочной пластины минимальное количество прививок для клеток, прикрепленных к стенке, составляет не менее 1 000 / отверстий (питательная среда 100 мкл). Чувствительность при тестировании лейкоцитов относительно низка, поэтому рекомендуется вакцинация не менее 2500 отверстий (питательная среда 100 мкл). Если вы хотите экспериментировать с 24 - или 6 - пористой пластиной, сначала рассчитайте соответствующее количество прививок на отверстие и добавьте раствор CCK - 8 в соответствии с 10% от общего объема питательной среды на отверстие.

Если нет 450 - нм фильтра, можно использовать фильтр с поглощением от 430 до 490 нм, но самая высокая чувствительность к обнаружению 450 нм.

Абсорбция фенольного красного цвета в питательной среде может быть устранена путем вычитания поглощения фона в пустом отверстии при вычислении и, следовательно, не влияет на обнаружение.