Чтобы решить эту проблему, команда разработчиков разработала мультимодальную платформу флуоресцентной визуализации, которая объединяет широкополосную флуоресцентную навигационную систему (WF - NV) с миниатюрной двухфотонной микровизуализацией и миниатюрной трехфотонной микровизуализацией. Чтобы в полной мере использовать преимущества однофотонного возбуждения, система WF - Nav оснащена функциями большого поля зрения и одноклеточного разрешения, которые позволяют быстро идентифицировать заданную область интереса. После определения местоположения в целевой области система может беспрепятственно переключаться на двухфотонную или трехфотонную визуализацию для дальнейшего достижения высокого коэффициента сигнала / шума или глубокой нейронной визуализации. Затем зонд m2PM или m3PM прикрепляется к голове мыши, освобождая ее для получения изображений свободной активности.

Рисунок 1. Конструкция многомодальной флуоресцентной системы визуализации

Система WF - Nav состоит из многоцветного широкополосного микроскопа с большим полем зрения и многофункционального адаптера. Система использует три светодиода в качестве источника возбужденного света (405 нм, 473 нм, 561 нм) и оснащена асферическими конденсаторными линзами с высокой апертурой для выпрямления светодиодных лучей, каждый из которых оснащен соответствующим набором фильтров. Чтобы обеспечить навигацию в большом поле зрения и обеспечить достаточное пространство для бесшовного переключения многофотонных зеркал, команда разработчиков разработала сухой объектив с большим рабочим расстоянием и низким увеличением. Объект (3.3x) имеет антидальнюю конструкцию: передняя группа обеспечивает отрицательную фокальность для двух склеенных двойных линз, а задняя группа состоит из монолитных сферических линз. Эта структура перемещает основную плоскость назад, чтобы исправить цветовую аберрацию, достигая рабочего расстояния сверхдлинного эффективного фокусного расстояния при сохранении числовой апертуры, что в конечном итоге приводит к прорывному показателю рабочего расстояния 90 мм и максимуму поля зрения изображения на уровне 5,64 мм.

Рисунок 2. Дизайн широкополосного флуоресцентного микроскопа

Чтобы обеспечить плавное переключение между широкополосным и многофотонным режимами визуализации, команда разработала многофункциональный адаптер. Этот адаптер соединяет объективы с широким полем и регулирует фокусное расстояние на электрической платформе оси Z. Благодаря стандартизированной конструкции зонда m2 / 3PM зонд может быть прочно установлен на одном и том же кронштейне и обеспечивает однородную фокусную визуализацию при переключении многофотонного и широкополосного режимов.

Рисунок 3. Многофункциональный адаптер и функция фокусировки

Этот объектив с рабочим расстоянием 90 мм обеспечивает достаточное пространство для работы головки, волоконно - оптического волокна или модуля со съемной электрической зум - линзой. Головной кронштейн устанавливается на легком прямолинейном шариковом слайде с минимальным сопротивлением скольжению (около 0,1 Н) и расстоянием растяжения 12 мм, что позволяет эффективно избежать риска столкновения объектива с образцом. Благодаря замене кронштейна головки система совместима с различными головками, такими как mini2P и m3PM. Кроме того, благодаря размерам и масштабируемой конструкции миниатюрного двухфотонного микроскопа система обеспечивает больший угол наблюдения в большинстве направлений по сравнению с обычными настольными объективами, что приводит к более широкому спектру наблюдений за образцами. Эта конструкция значительно повышает эффективность грубого позиционирования образца.

Рисунок 4. Сравнение углов наблюдения различных объективов и миниатюрных двухфотонных микроскопов

Затем разработчики оценили оптические свойства и практическое применение широкополосного флуоресцентного микроскопа. Изображение мозговых срезов мышей Thy1 - YFPH позволяет четко идентифицировать нейроны и аксоны. Ионная визуализация живого кальция на длине волны 470 нм, морфологическая визуализация на длине волны 561 нм позволили захватить 3804 нейрона, отмеченных GCaMP6f, и 4650 астроцитов мышей, экспрессирующих mCherry. Эти результаты свидетельствуют о том, что широкополосный микроскоп обладает многоцветной, одноклеточной разрешающей способностью и высокой пропускной способностью визуализации и обеспечивает отличную навигацию по интересующей области.

Видео 5. Миниатюрный широкополосный микроскоп

Чтобы сделать изображение M2PM более плавным для свободных мышей, разработчики разработали стандартизированный процесс визуализации, чтобы повысить эффективность изображения M2PM для свободных животных. Сначала животным вводят вирус и проводят хирургические операции, такие как имплантация окна черепа или имплантация GRIN Lens, а затем ждут 2 - 4 недели, чтобы обеспечить полную экспрессию вируса и восстановление хирургических травм. В одном из экспериментов мы пометили GCaMP6s и mCherry в нейронах первичной подвижной коры (M1), а затем закрепили мышей на беговой дорожке под устройством WF - Nav. Затем с помощью широкополосного микроскопа целевая область интереса определяется и направляется в центр поля зрения. Затем, переключаясь на режим m2PM, адаптер производит двухцветную двухфотонную визуализацию на длинах волн 920 нм и 1030 нм, а затем тонкую настройку оси XY и фокальной плоскости, чтобы определить конечную целевую область в течение нескольких минут. В большинстве случаев фокусная плоскость цели поднимается примерно на 25 мкм, чтобы компенсировать смещение фокуса, вызванное сжатием цемента, а Baseplate фиксируется на головке головы животного, где мыши могут свободно двигаться после примерно 10 минут отверждения.

Рисунок 6. Стандартизированный свободный процесс микрофотонной микровизуализации

Разработчики проверили систему, визуализируя кальциевые сигналы и структуру нейронов в социальных экспериментах на мышах, и весь процесс установки занял около 20 минут с коэффициентом успеха до 100% (n = 15), который был легко освоен даже неопытными исследователями, что значительно повысило эффективность эксперимента. Кроме того, многократное изображение нейронов второго слоя и астроглиальных клеток в зоне М1 в течение нескольких дней показало, что поле зрения стабилизировалось без повторной установки Baseplate.

Рисунок 7. Многодневное изображение одного и того же поля зрения

Благодаря стандартизированному механическому дизайну головка изображения m3PM может быть легко установлена на кронштейне. Применение многофункционального адаптера обеспечивает плавное переключение от широкополосного режима к трехфотонному режиму визуализации. Из - за ограниченной глубины визуализации широкополосного однофотонного микроскопа глубокие сигналы часто трудно обнаружить; В то время как поверхностные кровеносные сосуды могут служить в качестве ориентира, область инъекции вируса, которая сохраняет верхний слой, обеспечивает более прямую флуоресцентную маркировку, которая помогает нацелить более глубокие участки на вертикальную ось. Разработчики успешно зарегистрировали нейронную активность в области postsubiculum с поверхности коры до глубины 1020 мкм у мышей с фиксированной головой, экспрессирующей GCaMP6f, и провели эксперимент по исследованию поведения в открытом поле для мышей, чтобы зафиксировать долгосрочную активность сигнала кальция на глубине 670 мкм.

Рисунок 8. Миниатюрное изображение фиксированного и свободного поведения на трех фотонах

Эта работа была выполнена профессором У Рунлуном (автором сообщения) из Пекинского университета информационных технологий, Ван Айминем из Пекинского университета и профессором Чэн Хэпином из Пекинского университета.

[Ссылки]

Wu R, Sun Y, Hao Z, et al. Широкополевая флуоресцентная навигационная система для эффективного миниатюрного мультифотонного изображения у свободно ведущихся животных. Нейрофотоника. 2025; 12(2):025018. Дои:10.1117/1.NPh.12.2.025018