Полипептиды представляют собой биологические молекулы, соединенные несколькими аминокислотами через амидные (пептидные) связи, являются основными компонентами белка и основной структурой многих лекарств, гормонов, антибактериальных средств и сигнальных молекул. С развитием биомедицины, новых материалов и химической биологии искусственный синтез полипептидов стал важной технологией в области научных исследований и промышленности. В этой статье систематически описываются основные принципы синтеза полипептидов, основные методы, ключевые шаги и их применение.

1 Что такое полипептидный синтез?

Полипептидный синтез - это процесс химического соединения аминокислот в лабораторных или промышленных условиях в соответствии с заданной последовательностью аминокислот, образуя полипептидные цепи определенной длины и структуры. В зависимости от системы реакции, ее можно разделить на жидкий и твердофазный синтез. Среди них, твердофазный полипептидный синтез (Solid - Phase Peptide Synthesis, SPPS) был изучен американским химиком Р. Брюсом Меррифилдом в 1963 году и за это получил Нобелевскую премию по химии в 1984 году, теперь стал основной технологией.

Основные принципы синтеза твердофазных полипептидов

Основная идея SPPS заключается в том, чтобы соединить ковалентное соединение C - конца (карбоксильного конца) полипептидной цепи с нерастворимыми полимолекулярными смолами, а затем добавить аминокислоты один за другим, начиная с n - конца (аминокислоты), каждый из которых завершает цикл « деактивации - сцепления - стирания». Весь процесс выполняется на твердофазном носителе, и реактивы и побочные продукты могут быть удалены с помощью простой фильтрации и промывки, что значительно упрощает процесс очистки.

Ключевые этапы синтеза полипептидов

1. Выбор смолы и фиксация аминокислот головы

Синтез начинается с выбора подходящего твердофазного носителя (например, сцепленный полистирол, PEG - PS смола и т. Д.), поверхность которого имеет реактивные функциональные группы (например, гидроксилы смолы Wang, аминокислоты смолы Rink Amide). Карбоксильные основания первой аминокислоты соединяются со смолой через эфирные или амидные связи, и их альфа - аминокислоты нуждаются в предварительной защите.

Защита и деактивация аминокислот

Для предотвращения побочных реакций участвующие аминокислоты должны быть избирательно защищены:

Альфа - аминокислоты: часто используемые средства защиты Fmoc (9 - метилкарбонил) или Boc (трет - бутаноксикарбонил);

Активные группы боковой цепи (например, Эпсилон - аминокислоты Lys, тиогликолы Cys, карбоксильные основания Asp / Glu и т.д.): использование кислотно чувствительных защитных радикалов (например, tBu, Trt и т.д.);

Карбоксильные радикалы: обычно не защищены при твердофазном синтезе, поскольку они уже используются для сцепления.

Перед каждым раундом сцепления необходимо удалить защитные радикалы на N - конце полипептидной цепи на текущей смоле и подвергнуть воздействию экзотических аминокислот для следующей реакции.

3. Пептидные реакции (сцепления)

Активация следующих карбоксильных радикалов, защищающих аминокислоты (обычно используемые системы конденсации, такие как HBTU / HOBt / DIPEA, PyBOP, DIC / Oxyma), реагирует со свободными аминокислотами полипептидов на смоле, образуя новые пептидные связи. Реакция должна быть эффективной и быстрой, чтобы избежать сглаживания или образования побочных продуктов.

4. Крекинг и защита от боковой цепи

Когда синтез целевой последовательности завершен, полипептиды должны быть вырезаны из смолы с помощью сильных кислотных реагентов, таких как TFA, при удалении всех защитных радикалов боковой цепи. Стратегии Fmoc часто используют смесь TFA / воды / очистителя (например, TIS); Стратегии Boc требуют более жестких условий (например, HF или TFMSA).

5. Очистка и идентификация

Полученные при крекинге необработанные полипептиды содержат недостающие последовательности, побочные продукты и примеси, которые должны быть очищены с помощью антифазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP - HPLC). Затем используется масс - спектрометрия (MS) для подтверждения молекулярной массы, аналитический HPLC для оценки чистоты и, при необходимости, для анализа состава аминокислот или представления структуры круговой дихроматографии (CD).

Две основные стратегии синтеза: Fmoc vs Boc

проект	ФМОКЗакон	БокЗакон
альфа-Защита аминокислот	ФМОК(Щелочное удаление)	Бок(Кислотное удаление)
обеззараживающий реагент	20%Пиперидин/ ДМФ	ТФА
Защита боковой цепи	Кислотно - чувствительные (например,ТБУ)	Стабильные кислоты (например,Бзл)
Условия крекинга	ТФАШаг за шагом.	ПотребностиHFИли сильная кислота, эксплуатационная опасность
Безопасность и доступность	Высокий, Лабораторный мейнстрим	Низкий, специальные последовательности используются

В настоящее время стратегия Fmoc / tBu стала идеальным выбором для подавляющего большинства полипептидных синтезов из - за безопасности работы, мягких условий и высокой совместимости.

V. Применение полипептидного синтеза

Разработка лекарственных средств: например, аналогов инсулина, агонистов рецепторов GLP - 1 (димергропидов), антибактериальных пептидов и т.д.;

Разработка вакцин: синтетические антигенные эпипептиды для иммунологических исследований;

Фундаментальные научные исследования: подготовка маркированных пептидов, энзимных субстратов, рецепторных рецепторов и так далее;

Косметика и продукты для здоровья: такие как сигнальные пептиды (способствующие выработке коллагена), глютатин и т. Д.;

Материаловедение: самосборка полипептидных наноматериалов, биодатчиков и т.д.

VI. Вызовы и будущие направления

Хотя технология полипептидного синтеза достаточно развита, она по - прежнему сталкивается с такими проблемами, как низкая эффективность синтеза длинных пептидов, риск спинирования и труднорастворимость гидрофобных скоплений пептидов. Текущие исследовательские горячие точки включают:

Автоматизация и высокопроизводительная синтетическая платформа;

СВЧ - связь с ускорением;

Химические соединения (Native Chemical Ligation) синтезируют сверхдлинные пептиды или белки.

Зеленый растворитель вместо DMF;

Искусственный интеллект помогает в проектировании последовательностей и синтетической оптимизации.

Полипептидный синтез - это сложный проект, который объединяет органическую химию, высокомолекулярную науку и биотехнологию. От новаторской работы Merrifield до современной автоматизированной синтетической платформы, эта технология не только способствует развитию наук о жизни, но и демонстрирует огромный потенциал в области медицины и здравоохранения.