Краткое описание
3D - биопечать определяется как функциональная 3D - структура или искусственная тканевая модель клеточного и биосовместимого материала. Эта технология изменила область организационной инженерии, сделав возможным создание сложных предопределенных конструкций при одновременном обеспечении повторяемости. Несколько методов, основанных на 3D - биопечати, были сообщены для проектирования различных тканей, таких как хрящ, 2 кости, 3 и регенерация кожи. Эта технология также используется для создания новых доклинических моделей опухолей. Фактически, как 2D - модели культивирования клеток все чаще подвергаются сомнению из - за отсутствия предсказуемости, 3D - биопечать стала альтернативным способом обойти эту проблему, обрабатывая различные клетки и внеклеточные производные молекулы матрицы, моделирование / демонстрация микросреды опухоли (TME). Многие модели опухолей, основанные на 3D - биопечати, включают рак легких, рак молочной железы 5 и глиобластому 6. Эти модели демонстрируют преимущества в дизайне, гибкость и повторяемость по сравнению с другими стратегиями, такими как клеточные сферы и органоиды. Рак яичников является серьезной проблемой общественного здравоохранения, и 3D - биопечать все еще изучается в качестве модели рака яичников. В этом типе опухоли показано, что связанные с раком фибробласты (CAF) тесно взаимодействуют с раковыми клетками и играют ведущую роль в инвазивном раке и лекарственной устойчивости. Таким образом, CAFs являются ключом к разработке моделей рака яичников.
преимущество
Высококачественный скрининг и мгновенная транскрипция помогают отображать и проверять эксперименты 3D - биопечати • Мгновенная экспрессия генов является мощным инструментом для увеличения многофункциональности 3D - биопечатных моделей • Многоволновые аналитические инструменты необходимы для изучения взаимодействия различных типов клеток в моделях, в полной мере используя мощные возможности 3D - биопечатных моделей. В этом примечании 3D - биопечать используется для создания моделей рака яичников, содержащих раковые клетки (клетки SKOV3) и волокнистые клетки CAF (клетки MeWO). Для транскрипции клеток SKOV3 используются плазмиды GFP JetOPTIMUS (Polyplus) и для окрашивания клеток MeWO с помощью CellTracker и Orange CMRA Dye (ThermoFisher). Оба типа клеток содержатся в желатине - водорослях - на основе гидрогеля для получения цилиндрической опухолевой структуры. гомогенизация моделей и воспроизводимость распределения клеток в этих опухолях оценивалась с использованием ImageXpress Pico для систем визуализации.
Итоги и обсуждение
Как показано на рисунке 1, биопечатные структурные изображения показывают, что клетки SKOV3, экспрессирующие GFP, и гомогенизированные клетки MeWo, экспрессирующие флуоресцентное крашение, распределены по желатиново - водорослевым матрицам (рис. 1A и B). Это очень важно, потому что равномерное распределение гомогенных клеток в биологических чернилах является важным фактором, который необходимо учитывать в процессе 3D - печати 12. кроме того, естественный TME является типом клеток, которые, как известно, содержат множество тесных взаимодействий. Поэтому важно воспроизвести это, одновременно создавая модели опухолей in vitro для облегчения взаимодействия между раком и матричными клетками.
Опухоли должны сочетать несколько типов клеток, чтобы лучше имитировать гетерогенность TME, и количество и пропорции каждого типа клеток должны контролироваться для обеспечения повторяемости. ImageXpress Pico особенно подходит для такого управления, поскольку позволяет быстро и легко захватывать несколько микроскопических изображений. Программное обеспечение CellReporterXpress позволяет количественно измерять даже толстые образцы нескольких клеток, которые могут быть реализованы с помощью максимальной проекции Z - stack. В этом примечании эта система используется для анализа нашей биопечатной модели опухоли, которая демонстрирует хорошую повторяемость с точки зрения количества и пропорций клеток в 6 биопечатных структурах со средним количеством клеток SKOV3 (количество клеток FITC) 837 ± 200 (стандартное отклонение на 25%). Для клеток MeWo (число клеток TRITC) среднее количество составляет 3264.50 ± 462 (StD 15%).

На рисунке 1 анализируются 3D - биопечатные красители CMRA, содержащие клетки SKOV3, которые транскрибируют плазмиды GFP, и клетки MeWO, окрашенные CellTracker Orange. A) Изображения FITC и TRITC 3D биопечатных структур в отверстии B3, собранные с помощью системы ImageXpress Pico (4X, Z - stack). B) анализ маски для подсчета клеток FITC и TRITC, созданной с помощью программного обеспечения CellReporterXpress. C) Среднее количество клеток в каналах FITC и TRITC образца (5 отверстий, окрашивание и транскрипция) и отрицательный контроль (3 отверстия, без окрашивания и без транскрипции). D) Оценка эффективности транскрипции с использованием GFP плазмиды и JetOPTIMUS - Polyplus - Transfection - Transfection Backet (процентная доля FITC - положительных клеток / TRITC - положительных клеток).

Материалы и методы
Подготовка гидрогеля
Для приготовления гидрогеля желатин и натриевый порошок натрия взвешиваются требуемым качеством в течение 1 часа под ультрафиолетовым излучением, а затем растворяются в Dulbecco улучшенной EagleMedium, смешанной с lowest необходимой питательной средой (MEM), дополненной 10% сыворотки коровы. Полученный раствор затем остается на ночь при температуре 37°C при магнитном перемешивании и полностью гомогенизируется. Клеточная транскрипция и окрашивание В соответствии с инструкциями производителя, клетки SKOV3 транскрипции с использованием плазмиды JetOPTIMUS (Polyplus) GFP. 10 Короче говоря, соответствующее количество ДНК разбавляется в буфер JetOPTIMUS и соответствующим образом добавляется в реактив JetOPTIMUS для транскрипции. Транскрипционный раствор сохраняется при комнатной температуре в течение 10 минут, затем добавляется в культивируемые клетки SKOV3, которые культивируются в колбе T75 с 60 - 80% - ной степенью слияния. Клетки MeWO окрашиваются красителем CellTracker Orange CMRA (ThermoFisher) в соответствии с инструкциями производителя. 11 Короче говоря, краситель растворяется в DMSO для получения рабочего раствора и затем разбавляется в средах MEM. Клетки вылупляются при температуре 37°C в течение 30 минут. Затем удалите раствор реагента и замените его свежим.завершениеКультурные среды.

Рисунок 2 Методы биопечати и визуализации структуры модели рака яичников.