Краткое описание
Одноклеточное секвенирование РНК (scRNA - seq) - это метод, используемый для представления без отклонений экспрессии генов в сложных образцах клеток и тканей. Хотя scRNA - seq chedi изменил современную биологию, она по - прежнему технически сложна и часто дорогостояща. Текущие рыночные решения позволяют эффективно анализировать небольшую часть клеток, когда у них есть начальный пул из десятков тысяч клеток. Тем не менее, упрощенная схема, подготовленная библиотекой scrna - seq для обработки редких групп клеток, все еще отсутствует. Здесь мы разработали новый метод обнаружения пористой пластины для экономически эффективного и очень чувствительного SCRNA - seq. Этот рабочий процесс поддерживает подготовку редких образцов из редких групп клеток. В этом новом рабочем процессе (рисунок 1) мы использовали DispenCell и специальные детекторные ингаляторы (SEED Biosciences, Швейцария), со специальной и оптимизированной системой подготовки моноклеточной библиотеки (MERCURIUS High - чувствительный набор реагентов BRB - seq), Alithea Genomics， Швейцария).
Одноклеточное распределение
Во - первых, прежде чем секвенировать библиотеку, мы проверили способность DispenCell распределять отдельные клетки в специальных крекинговых буферах. Лимфоциты оттаиваются из замороженных бутылок, передаются дважды, а затем собираются в одноклеточной суспензии. Фильтруйте клетки с помощью 10 - мкм клеточного фильтра (Miltenyi Biotec, Германия), подсчитывайте и разбавляйте в растворах распределения метилцеллюлозы без RNAse (DispenMe, SEED Biosciences) до конечной концентрации 2×104 cells / ml. Затем 200 клеток были загружены из клеточной суспензии с помощью датчика DispenCell. Установите DispenCell, чтобы распределить одиночные клетки на 384 отверстия, которые предварительно оснащены 4,2 мкл расщепляющегося буфера (HS BRB seq, Alithea Genomics). Первые 96 отверстий выделены примерно на 7 минут. Затем, остановите распределение, потому что у нас достаточно образцов для анализа вниз по течению.
Моноклеточный контроль качества
Сразу же после распределения мы используем DispenSoft, программное обеспечение, разработанное SEED Biosciences, для последующей обработки одноклеточного контроля качества. Каждое отверстие в диафрагме представлено матрицей, кодированной цветом (рисунок 2.a). Когда отверстие содержит одну клетку, программное обеспечение помечает ее зеленой, в то время как красное отверстие содержит ноль или более клеток, которые должны быть выброшены. Чтобы отличить фрагменты от клеток, порог устанавливается путем управления дверью гистограммы на основе размера (рисунок 2.b). Только вершины выше порога считаются клетками.
Здесь мы получили 77 одноклеточных отверстий (80% скорости разделения одноклеточных клеток). Используя DispenSoft, исходные данные сопротивления также могут использоваться для записи процесса. Можно вручную проверять каждую кривую сопротивления. Однопиковый является характеристикой одной клетки (рисунок 2.c), в то время как несколько клеток производят несколько пиков. Это показывает, что DispenCell может распределять одиночные клетки в крекинговых буферах простым, быстрым и wanquan прослеживаемым процессом.