Протеин RolR происходит от глютеновой палочки и относится к ингибиторам семейства TetR. В природе его функция специфична: регулируя экспрессию генов бактерий, идентифицируя и связывая « резорцин» (химические вещества, широко используемые в промышленном производстве), помогая бактериям справляться с резорцином в окружающей среде, извлекая выгоду и избегая вреда.

Эта « специализация» в научных исследованиях является как преимуществом, так и ограничением. Ученые поняли, что если RolR « научатся» распознавать больше молекул, то можно будет разработать недорогие и высокочувствительные биодатчики, которые будут использоваться для мониторинга окружающей среды (например, для обнаружения вредных ароматических веществ в промышленных сточных водах), синтеза наркотиков (для мониторинга концентрации промежуточных веществ в фармацевтических препаратах в режиме реального времени) и даже диагностики заболеваний (для выявления молекулярных маркеров, связанных с болезнью).

Чтобы дать RolR новые возможности, исследователи используют технологию « направленной эволюции», которая имитирует ускоренную функциональную оптимизацию естественных эволюционных процессов и продвигается в три ключевых шага:

RolR идентифицирует основной резорцин с помощью « комбинированного кармана», форма кармана и состав аминокислот определяют тип молекулы, которую он может связывать. Исследователи отобрали 19 ключевых аминокислот, расположенных в кармане или вблизи него. Точные мутации этих аминокислот производятся с помощью технологий « Комбинированный тест на насыщение активных участков (CAST) » и « итеративная индукция насыщения (ISM) » для создания массивных вариантов RolR (рис. 1.A - C). Стоит отметить, что исследователи специально сохранили аминокислоту D149 - « ключевой рычаг» RolR для распознавания резорцина, мутация которого может привести к полной потере функции.

В мутантном репозитории только несколько из них могут одновременно удовлетворять двум условиям: как нормально связывать регулируемые ДНК гены (обеспечивающие основные функции), так и « активироваться» новыми целевыми молекулами (приобретая новые функции). Исследователи использовали белок TetA antiporter для разработки системы « двойного выборо» (рисунок 1D, рисунок 2):

Этот метод скрининга может эффективно исключать « неквалифицированные» варианты и в конечном итоге оставлять высококачественных кандидатов с « полным функционалом + новым молекулярным ответом».

Исследовательская группа не остановилась на вариантах первого поколения. Используя в качестве шаблона варианты, идентифицирующие катехины, они продолжили свою мутантную оптимизацию и в конечном итоге получили вариант RolR, который распознает шесть новых молекул, в том числе:

Полезность биодатчика во многом зависит от того, сможет ли он работать в разных хозяевах. Исследовательская группа « пересадила» модифицированный вариант RolR в винодельческие дрожжи (широко используемую модель эукариотической биологии) (рисунок 3) и обнаружила:

Результаты исследования поверхности, модифицированный RolR имеет межвидовую применимость, закладывая основу для его применения в эукариотах (например, метаболический мониторинг на дрожжевых клеточных заводах).

От специального распознавания резорцинов до того, чтобы стать « многогранным», способным различать различные молекулы, процесс трансформации RolR демонстрирует основное очарование синтетической биологии - точное управление биологическими молекулами дает жизнь совершенно новые функции и решает реальные проблемы, стоящие перед человечеством. Эта направленная эволюционная структура применима не только к RolR, но и к другим АТФ и связывающим белкам, открывая двери для разработки большего количества « персонализированных» биодатчиков. Возможно, в ближайшем будущем эти крошечные белковые датчики войдут в нашу жизнь и станут « невидимыми стражами» окружающей среды, здоровья и промышленного производства.