Разработка вакцин, от НИОКР до ранних доклинических исследований до коммерческого производства, тестирования и выпуска партий, включает в себя множество анализов и тестов для обеспечения эффективности и безопасности вакцинных продуктов. Биологический анализ в процессе разработки вакцин сталкивается с проблемами, связанными с матрицами образцов, типами анализируемых веществ и эффективностью рабочего процесса, такими как большие различия в образцах вакцин, используемых для анализа, и широкий спектр анализов, включая полисахариды, белки и полипептиды, которые должны быть обнаружены в разных матрицах. Кроме того, вакцины нового поколения включают в себя все больше антигенов, таких как ВПЧ (ВПЧ - вирус папилломы человека), которые имеют несколько типов, таких как двухвалентные, четырехвалентные и девятвалентные, что, в свою очередь, значительно усложняет тестирование. Иммунный анализ ELISA, основанный на пористых пластинах, стал одним из золотых стандартных методов в биоанализе вакцин, включая количественные антигены, оценку уровней примесей и мониторинг титров и иммуногенности при разработке вакцин. Тем не менее, все более срочный график проекта побудил исследователей начать искать улучшения в производительности иммунологического анализа вакцин, в том числе:

Используйте меньшее количество ценных реагентов, таких как кандидаты на вакцины, а также образцы от мелких подопытных животных

Методы тестирования позволяют легко обрабатывать образцы сыворотки и плазмы крови, алюминиевых добавок и масляных добавок

Уменьшить время работы

Сокращение времени разработки методов обнаружения

Gyrolab ® Система обеспечивает решение этих потребностей и предоставляет много дополнительных преимуществ в разработке вакцин. Открытая платформа Gyrolab поддерживает быстрое тестирование и разработку различных аналитических материалов, типов образцов и формул, а также предоставляет наборы реагентов для широкого спектра применений. Gyrolab в Bioaffy ™ Обновленные иммунологические тесты, проводимые на компакт - дисках с микропотоком, сводят к минимуму помехи со стороны различных матриц, а потребление образцов и реагентов невелико для удовлетворения потребностей последнего поколения вакцин и испытаний на небольших экспериментальных животных; Режимы высокой пропускной способности и автоматизации, которые проводят параллельный анализ нескольких аналитических объектов, значительно сокращают время работы и позволяют быстро предоставлять данные, чтобы соответствовать сложным графикам проектов и более быстрым решениям. Рабочие станции Gyrolab отвечают требованиям части 11 CFR 21 и разрабатывают методы тестирования и данные, отвечающие требованиям нормативной среды и обеспечивающие беспрепятственную передачу данных между фармацевтическими предприятиями и CRO.

　　В этой статье представлены несколько примеров применения системы Gyrolab для повышения производительности и эффективности разработки вакцин, чтобы проиллюстрировать преимущества системы Gyrolab в практическом использовании.

Случай 1:Тестирование антигенных специфических антител в сыворотке крови в течение 1,5 часов

Проверка количества и качества антител, вырабатываемых B - клетками памяти (MBC) у вакцинированных пациентов, является ключом к пониманию того, как индуцировать пожизненные защитные антитела. Относительная частота B - клеток с антигенной специфической памятью в периферической крови человека обычно определяется методом непрерывного ограниченного разбавления (serial limiting dilution assay, sLDA) и анализом ELISA, но этот метод требует много времени, усилий и большого количества экспериментальных материалов, поэтому исследователи - разработчики вакцин и диагностики компании Novartis перенесли иммунометрию ELISA на систему Gyrolab, чтобы увеличить производство. Цель исследования состояла в том, чтобы вакцинировать мышей после комбинации антигена Neisseria с тремя добавками для определения подтипа IgG, генерируемого клетками B памяти мышей с помощью иммунологических тестов. Исследователи протестировали две формы тестирования:

　　Прямое обнаружение (Direct Assay).

Для оценки: (1) способности биогенных антигенов связываться с родственными колоннами стрептомицина в микропотоковых компакт - дисках Gyrolab Bioaffy и захватывать специфические IgG; Тестирование чувствительности антигенных специфических антител в очищенной жидкости, культивируемой клетками; По кривой связывания в Gyrolab Viewer оценивается сродство антитела к конкретному антигену.

　　Обратное обнаружение (Reverse Assay).

Способность IgG, используемая для оценки флуоресцентных маркеров Alexa, обнаруживать антигены в сочетании с CD - сродством.

Прямое испытание

Рисунок 1. Тесты Gyrolab и ELISA выявили одинаковые положительные и отрицательные образцы в B - клеточном растворе, выращенном у мышей, которым были сделаны прививки Nasser. Ось Y - это титры антител, обнаруженные Gyrolab, а положительные образцы, идентифицированные ELISA, отмечены зеленой рамкой.

Диаграмма 2. Метод прямого обнаружения Gyrolab позволяет одновременно обнаруживать антитела различных подтипов IgG в нескольких микролитрах проб.

По сравнению с ELISA, тестирование на антигенные специфические антитела в системе Gyrolab имеет много преимуществ, и всего несколько микролитров образцов могут анализировать качество реакции антитела, то есть относительное количество подтипов IgG.

Случай 2:Скрининг реагентов - сравнение партий вакцин, используемых для тестирования выпуска

Биологический анализ поливалентных вакцин становится все более сложным и требует разработки большого количества методов тестирования. Поскольку поливалентная вакцина содержит несколько антигенов, для каждого антигена необходимо разработать метод тестирования, чтобы обеспечить дозу и эффективность, поэтому количество испытаний каждого продукта умножается на количество антигенов. Группа разработчиков по анализу вакцин Merck в США разработала очень гибкий метод тестирования Gyrolab, который минимизирует разработку методов тестирования поливалентных вакцин и потребление реагентов (например, маркированных антител). Метод основан на биогенном козьем анти - мышином IgG, прикрепленном к столбу родства стрептоплесени Gyrolab Bioaffy CD, добавляя специфические антитела захвата для анализа (например, альфа - PS mAb для мышей), а затем добавляя образец, затем обнаруживая захваченный анализ с помощью второго специфического антитела для анализа (например, альфа - PS pAb у кролика) и, наконец, Alexa Fluor ® 647 маркированных антител осла против кролика для флуоресценции (рисунок 3). Эта 5 - слойная форма « двойного заполнителя» не требует маркировки реагентов, предназначенных для конкретного анализа, и аналитические специфичные реагенты могут быть легко заменены, поэтому для обнаружения поливалентных полисахаридных и поливалентных белковых вакцин и различий между партиями антисывороток требуется только минимальное развитие.

Рисунок 3. 5 - слойная форма обнаружения Gyrolab с двойным заполнителем. PS: Полисахаридный анализ

Метод Gyrolab был использован для сравнения двух партий антисыворотки для трех антигенов. Используя программный модуль Gyrolab Viewer, можно визуализировать комбинационную реакцию каждой точки данных на сродстве в микроканале CD, что делает данные сопоставимыми с более трудоемкими кривыми эффективности (рисунок 4).

Рисунок 4. Panel A: Для сравнения антисывороточных партий исходных A, B и C используются данные об интенсивности флуоресценции (слева) и кривые реакции (справа). Panel B: Антиген B Gyrolab Viewer в сочетании с изображением кривой интенсивности показывает низкую интенсивность флуоресценции на колонне новой партии и увеличение пикового хвоста, что указывает на более низкую сродство антител в этой партии, чем в старой.

В то время как обе партии имели схожие результаты против исходного A, более старые партии показали лучшую эффективность против исходного B, с большей пиковой площадью в сочетании с спектральными картами в Gyrolab Viewer и более высоким коэффициентом сигнала и шума при титровании. Новая партия показывает ярко выраженный флуоресцентный хвост на колонне, что указывает на более низкую сродство с антигенами. Для антигена C обе партии антисыворотки показали явное явление перетаскивания хвоста, а старая партия антисыворотки показала больше пикового перетаскивания хвоста. При титровании фон старой партии выше, сигнал и шум относительно низки. Таким образом, визуализация Gyrolab Viewer в сочетании с спектрограммой, кривой реакции и соотношением сигнала и шума дает ценное представление о партиях антисыворотки.

Команда Merck пришла к выводу, что система Gyrolab предоставляет ценные статистические и графические данные, которые в совокупности оцениваются в соответствии с данными испытаний на основе пористых пластин, а также дополнительные преимущества, такие как быстрое время оборота, высокий поток и способность визуализировать прочность.

Случай 3:Динамический диапазон антигенного титра увеличен до 4 logs

Компании по разработке вакцин должны расширить динамический диапазон иммунометрии для измерения гликопротеиновых антигенов, адсорбируемых на алюминиевые добавки. Исследователи переместили ELISA на систему Gyrolab, расширив динамический диапазон от 5 - 300 мIU / mL до ~ 0,6 - 40 000 мIU / mL, а обнаружение Gyrolab расширило как верхний, так и нижний пределы количественной оценки.

Рисунок 5. Гиролаб обеспечивает мощный метод обнаружения, который значительно расширяет динамический диапазон при измерении антигенных капель.

Случай 4:Испытания эффективности вакцин в поддержку разработки формул

Оценка согласованности эффективности между партиями является важным компонентом контроля качества вакцин. Испытания на эффективность могут использоваться для исследований стабильности, проверки и оптимизации процессов ферментации и очистки, сравнения старых и новых установок и оценки последствий изменения формулы или добавки.

Американская компания Merck сравнила результаты испытаний системы Gyrolab и Luminex на мышах. Исследование включало иммунитет в организме мышей, разбавляя нормализованные образцы антигенов до 6 - 12 доз концентрации. Эффективная доза (ED50) была определена на основе максимальной дозы, преобразованной в 50% сыворотки мыши в каждой группе, и для получения значения ED50 требовалось до 220 образцов сыворотки мыши, поэтому эта громоздкая работа требовала большого количества небольших образцов. Обнаружение Gyrolab оказалось надежным и надежным, его чувствительность и воспроизводимость (CV < 10%) сопоставимы с измерением Luminex (R2 = 0,97), но время работы короче и время оборота быстрее.

Рисунок 6. Обнаружение Gyrolab отличается высокой степенью повторяемости, CV<10%

Диаграмма 7. Результаты иммунологических тестов Gyrolab и Luminex сопоставимы