Альфа - меланоцитокин (α - MSH) отвечает за запуск производства мелатонина, который является естественной защитой организма от ультрафиолетового (УФ) излучения. Воздействие ультрафиолетовых лучей на кожу способствует образованию α - MSH; Тем не менее, стимуляция биосинтеза мелатонина до воздействия ультрафиолетового излучения может предотвратить рак кожи, вызванный ультрафиолетовым излучением.

Учитывая, что естественная форма α - MSH слишком нестабильна в организме, чтобы ее можно было применять в качестве терапевтического агента, были синтезированы различные аналоги, одним из которых был MT - II (рис.

Диаграмма 1

　　Поскольку производство MI - II часто требует увеличения до уровня KG для удовлетворения клинических потребностей, оптимизация технологических условий в лабораторных масштабах должна учитывать масштабируемость процесса.

　　

　　Компания Gyros Protein Technologies поставляет полипептидные синтезаторы от лабораторных до экспериментальных уровней, которые помогают успешно масштабироваться от стадии разработки до коммерческого производства.

В этом примере будет рассмотрена оптимизация и усиление путей полностью автоматического синтеза, а именно синтеза линейных последовательностей и эндоамидирования на смоле конечного пептида. В этой работе оптимизация массового синтеза МТ - II осуществляется в три этапа:

　　1Найдите подходящие варианты защиты от циклизации смолы;

　　2Небольшая оптимизация условий синтеза и завершение циклизации с помощью PurePep Chorus, полностью автоматическая работа прибора;

　　3На экспериментальном синтезаторе PurePep Sonata + синтезируется MT - II с использованием ранее оптимизированных условий.

　　01Найдите подходящий вариант защиты от смолы.

Структура МТ - II завершается после образования внутриамидных мостов между аспарагином и лизином, и эти остатки должны быть выборочно защищены перед циклизацией смолы. Поэтому идеально найти защитную группу боковой цепи, которая может сопровождаться удалением, чтобы минимизировать сложность снятия защиты. На первом этапе этого эксперимента для синтеза MT - II используются различные комбинации защитных групп боковой цепи:

1Asp (ODmab) / Lys (ivDde)

2Asp(O-2-PhiPr)/Lys(Mtt)

3Asp (OAlly) / Lys (Alloc)

Его можно одновременно и выборочно удалять раствором DMF 2% гидразина, раствором DCM 1% TFA и раствором DCM в палладии - IV (трифенилфосфин) (Pd (Pph3) 4) и фенилсилане (PhSiH) соответственно. Чистота конечного пептида показана в таблице 1.

Таблица 1 Чистота грубых пептидов MT - II, синтезированных различными комбинациями защитных групп боковой цепи

При сравнении различных схем защиты комбинация 2 получает самую высокую чистоту грубых пептидов. Тем не менее, Fmoc - Asp (O - 2 - PhiPr) - OH является относительно дорогим и увеличивает затраты на последующее увеличение производства. Комбинация 1 получает наименьшую чистоту грубых пептидов, что связано с неэффективным обеззараживанием ODmab и ivDde путем обработки 2% гидразина. Кроме того, хотя комбинация 3 показала гораздо более низкую степень грубой чистоты, чем комбинация 2, она была проанализирована в основном с образованием аспарагина. Минимизируя эту побочную реакцию, можно значительно повысить чистоту грубых пептидов. Поэтому Asp (OAlly) / Lys (Alloc) был выбран в качестве синтеза мономера MT - II и следующей оптимизации.

　　02 Небольшие оптимизированные условия конденсации

Сначала мы изучили DIC и OxymaPure для фаз сцепления без предварительной активации (4) и предварительной активации в течение 5 минут (5). Как и в комбинации 3, эти методы приводят к значительному снижению чистоты грубых пептидов из - за образования аспарагина (таблица 2). Таким образом, MT - II синтезируется постепенно: пептиды синтезируются в His (His - D - Pe - Arg - Trp - Lys (Alloc) - смолу) и конденсируются Asp (OAlly) с помощью HCTU / NMM (6) или DIC / OxymaPure (7). После конденсации Asp (OAlly) проводится микрорезка, в которой образование аспарамида не наблюдается. Эти фрагменты имеют общую чистоту 88,9%.

Таблица 2 Чистота синтеза MT - II в различных условиях

　　Синтез линейных пептидов

Линейный MT - II синтезируется в 100 мкмоль на PurePep Chorus на смоле Rink Amide MBHA (0,35 ммоль / г). Перед синтезом смола растворяется в DMF 2×10 минут. Этап снятия защиты выполняется 20% - ным раствором DMF пиперидина в течение 2 × 5 минут, а этапы конденсации - 5 - эквивалентным раствором AA, 5 - эквивалентным DIC и 5 - эквивалентным раствором OxymaPure DMF (без предварительной активации - 4 или 5 - минутной предварительной активации - 5) в течение 30 минут при комнатной температуре. Для сегментов 7 и 9 Asp (OAlly) и Nle конденсируются при тех же условиях, что и 5. Для сегментов 6 и 8 при комнатной температуре Asp (OAlly) и Nle конденсируются с HCTU (эквивалент 5) и NMM (эквивалент 10) в DMF, время предварительной активации составляет 5 минут, а время однократной конденсации - 30 минут. Конечный амид МТ - II ацетилируется 10% Ac2O раствором DMF при комнатной температуре в течение 30 минут.

Избирательное удаление защитной группы боковой цепи Asp и Lys: снятие защиты Asp (OAlly) и Lys (Alloc) стирается при комнатной температуре дважды в течение 60 минут раствором DCM 0,2 - эквивалентного Pd (PPh3) 4 в 24 - эквивалентном PhSiH, а затем три раза с DCM и DMC.

　　эпициклизация смолы

При комнатной температуре смола циклизируется в растворе DMF в течение 60 минут с использованием пироксима (эквивалент 5) и DIPEA (эквивалент 5).

　　разрезка

Смола промывается DMF 3 раза, DCM 6 раз и высыхает в течение 20 минут. Каждая резка производится смесью TFA / EDT / H2O / TIS (94: 2.5: 2.5: 1) при комнатной температуре в течение 60 минут, а затем осаждается в эфир.

　　03在 Соната PurePep+ 上放大 МТ-II 的合成

Небольшая оптимизация синтеза на PurePep Chorus показала, что вариант 8 является оптимальным. Массовый (5 мм) синтез MT - II на PurePep Sonata +.

В соответствии с методом и условиями синтеза схемы 8, MT - II синтезируется на PurePep Sonata + до Asp (OAlly) [Fmoc - Asp (OAlly) - His - D - Phe - Arg - Trp - Lys (Alloc) - Смола], после чего выборочно удаляется защитная группа боковой цепи для последующей циклизации смолы. После циклизации последовательность завершается добавлением Nle и N - концевого ацетилирования. В соответствии с этой стратегией был получен MT - II с грубой чистотой 80,2%, что сопоставимо с чистотой грубых пептидов, синтезированных в размере 0,1 мм на PurePep Chorus.

　　заключение

• Многоканальный многофункциональный полностью автоматический синтезатор PurePep Chorus позволяет осуществлять синтез MT - II в небольших масштабах и исследовать и оптимизировать различные условия синтеза, а затем успешно переносить оптимальные условия синтеза на PurePep Sonata +, увеличивая размер синтеза со 100 мкмоль до 5 мм (в 50 раз), получая почти одинаковую чистоту грубых пептидов на уровне 80,1%.

•Благодаря гибкости PurePep Chorus, MT - II представляет собой полностью автоматический синтез от начала до конца: от линейных полипептидов до селективной боковой цепной деактивации и кольцевания смолы, каждый шаг выбирает различные условия конденсации и может быть протестирован в режиме онлайн для извлечения образцов микрорезанием в процессе синтеза для корректировки условий в соответствии с результатами эксперимента. Процессы на PurePep Chorus могут быть легко перенесены в PurePep Sonata + и получить тот же результат.