Внеклеточные капсулы (EV) За последнее десятилетие произошло быстрое развитие, и было сделано много открытий и сообщений о его происхождении, корреляции заболеваний, а также о диагностике и лечении. В этих областях исследований, которые имеют решающее значение для всестороннего представления EV, необходимо охватить моночастицы EV и общий анализ, такой как зернистость, потенциал, концентрация, распределение диаметра частиц, а также обнаружение характерных белков, связанных с EV, таких как CD9, CD63, CD81, Alix и TSG1012 - 5. Для более глубокого анализа фенотипов EV необходимо использовать такие методы, как Western blotting, ELISA или монокапсульный / общий иммунный маркер.
В настоящее время нет способа обнаружить белки на отдельных пузырьках в целом.Распределение частицСочетание измерения концентрации. Анализ отслеживания наночастиц (NTA) - это метод, используемый для представления распределения частиц EV. NTA основана на уравнении Стокса - Эйнштейна, отслеживая отдельные частицыБрауновское движениеОпределение размеров отдельных групп EV и EV. Используя лазерное облучение частиц, NTA теоретически может достичь специфичности флуоресцентных красителей для возбуждения и обнаружения флуоресцентных маркеров EV (NTA - FL).Тем не менее, только несколько исследований в настоящее время критически оценивают NTA - FL, и эти исследования основаны на иммунных маркерах нетипичных белковых мишеней EV или неспецифических маркеров.А.
Университет Тафтса (Университета ТафтсаИсследователи сообщили об оптимизированном алгоритме для NTA - FL флуоресцентных иммунных маркеров отдельных EV, что делает однопузырчатые иммунные маркеры на основе NTA более точными с анализом распределения частиц и концентрации. Алгоритм может эффективно повысить достоверность результатов тестирования NTA и предоставить мощный инструмент для более глубокого изучения функций и механизмов EVА.
В предыдущих исследованиях исследователи обнаружили, что традиционные利用Государственные налоговые органыпроводитьEVПодтипная флуоресценция/Метод сравнения рассеянного света приводит к отклонению данныхОбычно отношение площади, окруженной кривой флуоресценции (FM), к площади, окруженной кривой рассеянного света (LSM), может указывать чистоту EV. Но эти исследователи обнаружили в ходе анализа, что в тестах 1, 2, 4 (таблица 1, рисунок 1) отношение FM (голубая линия) к LSM (красная линия) более 100%, что указывает на чистоту EV более 100%, что явно необоснованно, и этот результат теста показывает:1. В процессе флуоресцентного обнаружения может появляться большое количество ложных сигналов.
Технические ограничения системы NTA не позволяют LSM обнаруживать очень небольшие EV или другие частицы с низкой скоростью преломления.В режиме рассеянного света обнаружение EV было неполным, и некоторые данные EV не были обнаружены, в результате чего площадь LSM была небольшой, что привело к соотношению более 100%.
Исследователи также обнаружили, что FM - режим также имеет очевидные пики сигнала в области ниже 50 нм, в то время как по сравнению с LSM - режимом его сигнал при 50 нм в основном распадается до 0, что также может быть одной из причин соотношения более 100%.В частности, это может быть недостаточное удаление свободных флуоресцентных молекул, а свободные белки в системе маркируются флуоресцентными молекулами, что приводит к усилению флуоресцентных сигналов в небольших сегментах.
Таблица 1 Соотношение площади флуоресценции (FM) и площади рассеянного света (LSM) в различных образцахРисунок 1 Результаты тестов NTA в различных образцах в FM и LSM режимах
Для решения этой проблемы исследователи предложили два метода оценки:
Первый способЭто традиционный метод расчета, который вычисляет количество частиц более 50 нм в выборке и сравнивает количество частиц в FM и LSM, чтобы получить соотношение между FM и LSM. (Рисунок 2b, c)
Второй способЭто оптимизированный метод расчета, который вычисляет перекрывающуюся область между кривыми распределения частиц, полученными двумя методами, и сравнивает эту область с общим количеством частиц более 50 нм в LSM, чтобы получить долю перекрывающейся области. (Рисунок 2d)
В ходе исследования исследователи подчеркнули свой выбор в отношении размера частиц. Для более точного анализа EV исследователи сузили анализ до50 - 200 нм.Причина, по которой был выбран этот диапазон, заключается в том, чтоБольшинство EV находятся в этом диапазоне.К тому же,LSM имеет ограниченную способность обнаруживать частицы размером менее 50 нмВ то время как частицы, превышающие 200 нм, могут не быть EV. Поэтому диапазон анализа сужается до50 - 200Нано может эффективно исключать другие типы частиц и повышать точность результатов анализаА.
Рисунок 2 Схема алгоритма иммунной маркировки на основе NTA
Основываясь на этом алгоритме оптимизации, исследователи проанализировали данные из шести наборов образцов, описанных выше, и результаты показали, что чистота EV упала менее чем на 100%.
Таблица 2 Отношение площади флуоресценции (FM) к площади рассеянного света (LSM) для различных образцов после оптимизации алгоритма (SA)
Используя квантовую точечную маркировку и технологию NTA - FL, вышеупомянутые алгоритмы, сравнивая результаты флуоресцентных режимов (FM) и рассеянных световых режимов (LSM), могут эффективно идентифицировать и анализировать различные подтемы EV на уровне отдельных пузырьков и предоставлять более точную информацию о распределении частиц. Тем не менее, хотя технология NTA - FL и алгоритмы оптимизации могут эффективно повысить точность анализа подтипов EV, важно также признать, что технология NTA имеет некоторые ограничения в базовых принципах.NTA обнаруживает очень маленькие EV илиШирина распределения по диаметру частиц的Образцы (особенно образцы EV)Когда есть определеннаяТрудностиПоэтому, хотя технология NTA - FL и алгоритмы оптимизации могут повысить точность распределения частиц и анализа концентрации,Технические проблемы NTA не были преодолены.Последующая оптимизация алгоритма и метод флуоресцентной маркировки могут бытьПолучение правильного результата на неправильной основеНеобходимо проявлять осторожность, с тем чтобы избежать чрезмерной зависимости от данных, получаемых с помощью этой технологии.Наночастицы NanoCoulterпринцип КуртаПреодолевая ограничения оптического принципа, можно точно анализировать каждую перфорированную частицу, достигая истинного значения обнаружения одной частицы, более широкого распределения диаметра частицыДискретная системаОбразцы имеют лучшие результаты измерений. И не зависит от скорости преломления образца, поглощения света и других оптических свойств, данные не соответствуют, наиболее реальное состояние образца реакции.
