I. СОДЕРЖАНИЕАвтоматический прибор PCRПодготовка перед операцией

Приготовление реагентов и расходных материалов

Реакторы: включают шаблоны ДНК, специфические экстракты (как положительные, так и обратные), dNTP (четыре типа ДНК - нуклеотидов), высокотемпературные ДНК - полимеразы (например, ферменты Taq), буферные жидкости и растворы Mg² - ионов. Все реагенты должны быть смешаны после полного таяния, чтобы избежать ошибки концентрации.

Расходные материалы: использование одноразовой стерильной трубки PCR или 96 - дырочной пластины для обеспечения хорошей герметичности и предотвращения перекрестного загрязнения.

Операции по зонированию: в зоне готовности реагента (сверхчистый рабочий стол или шкаф биологической безопасности) завершается подготовка системы, при работе надеваются перчатки и избегаются речи, уменьшается загрязнение аэрозолями.

Контроль приборов

Убедитесь, что прибор PCR размещен на горизонтальной прочной платформе, напряжение питания соответствует и заземлено хорошо.

Проверьте, чиста ли ванна для образцов, чтобы избежать воздействия остатков на температурную проводимость.

Регулярно промывайте раковину с мыльной водой, запрещается использование сильнощелочи, высокой концентрации алкоголя или органических растворителей.

II. Составление реакционной системы

Смешанный реактив

Шаблоны ДНК, экстракты, dNTPs, ДНК - полимеразы, буферы и раствор Mg² добавляются в стерильную центрифужную трубку пропорционально, добавляя соответствующее количество двойного пара для определения конечного объема (рекомендуется 15 - 50 мкл).

Ключевые параметры:

Качество шаблонов ДНК: Избегайте деградации или загрязнения ингибиторами, иначе это повлияет на эффективность амплификации.

Конструкция экстракта: обеспечивает специфичность, избегает димеров или самокомплементарных структур, температура отжига должна соответствовать значению Tm экстракта.

Концентрация Mg² ⁺: Высокая или слишком низкая ингибирует активность фермента и должна быть скорректирована в соответствии с инструкцией по реагенту.

Раздельная система

Смесь быстро распределяется в трубку PCR, закрывая крышку трубки или покрывая специальную пленку, с коротким центрифугированием (1000 - 2000 rpm, 1 минута), чтобы жидкость опустилась на дно трубки.

Настройка программы PCR

Параметры температурной программы

Начальная дегенерация: 94–98°C, 20–30 секунд, так что ДНК - двойная цепь полностью отделена.

Циклическая дегенерация: 94–98°C, 20–30 секунд, поддержание состояния одной цепи.

Отжиг: 50 - 65°C, 20 - 40 секунд, экстракт и специфичность шаблона в сочетании (температура отжига должна быть оптимизирована градиентом PCR).

Расширение: 72°C, 1 минута / kb фрагментов ДНК, Taq фермент синтезирует новые цепи.

Количество циклов: 20 - 40, скорректировано в соответствии с плотностью залегания целевого сегмента.

Окончательное удлинение: 72°C, 5 - 10 минут, убедитесь, что все фрагменты растягиваются полностью.

Температура хранения: 16°C, 2 минуты (избегайте чрезмерного износа компрессора, запрещается устанавливать для бессрочного хранения 4°C).

Дополнительные функциональные параметры

Температурный градиент: Установите температурный градиент (например, 50 - 65°C) на этапе отжига, одновременно проверяя несколько температур отжига и оптимизируя экспериментальные условия.

Скорость нагрева (Ramp Rate): Корректировка скорости нагрева / охлаждения (например, 3°С / с) для сокращения времени реакции.

Инкремент цикла (Increment): увеличение температуры или времени после каждого цикла (например, 0,1 °C на цикл) для специальных экспериментов, таких как Touchdown PCR.

Сохранение и запуск программы

Введите имя программы после сохранения, поместите трубку PCR в желоб образца, закройте тепловую крышку и затяните.

Программа запуска, которая контролирует температуру и время во время работы через экран в режиме реального времени, поддерживает приостановку, пропущенные шаги или прекращение программы.

IV. Постэкспериментальная обработка

Анализ продуктов

Сразу после окончания реакции трубка PCR удаляется, и размер и концентрация продукта анализируются с помощью электрофореза или флуоресцентного теста агаринового геля (например, SYBR Green).

Если используется метод флуоресцентной маркировки, необходимо убедиться, что параметры прибора (например, длина волны возбуждения, значение усиления) соответствуют реагенту, чтобы избежать помех фонового сигнала.

Техническое обслуживание приборов

Перед выключением прибора нагреваемый модуль естественным образом охлаждается до комнатной температуры, чтобы предотвратить повреждение от теплового напряжения.

Регулярно откалибруйте датчики температуры, чтобы обеспечить точность температуры (например, используя стандартный калибровочный агент с температурой плавления).

Очистите желоб для образцов и тепловую крышку, проверьте, не стареет ли уплотнительное кольцо, и своевременно замените изношенные детали.

V.Автоматический прибор PCRМеры предосторожности

Предотвращение загрязнения и борьба с ним

На протяжении всего эксперимента следовал принципу « безнуклеиновой кислоты», используя специальные детекторы, головки пистолетов и комбинезоны, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

Установите отрицательный контроль (без шаблона) и положительный контроль, чтобы контролировать надежность экспериментальной системы.

Безопасные операции

Избегайте открытия тепловой крышки во время работы PCR, чтобы предотвратить высокотемпературные ожоги или испарение образца.

Запрещается использовать инструменты для очистки коррозионной жидкости, чтобы предотвратить повреждение электронных элементов.

Устранение неполадок

Отсутствие продуктов усиления: проверка качества шаблона, конструкции экстракта или программных параметров (например, высокая температура отжига).

Неспецифические полосы: оптимизация температуры отжига или увеличение времени удлинения, уменьшение образования димера.

Колебания температуры: Свяжитесь с инженером для калибровки прибора, чтобы убедиться, что однородность температуры соответствует стандарту (например, ±0,2°C).