Предисловие

Антитела - маломолекулярные лекарственные соединения (antibody drug conjugates, ADC) - это класс терапевтических биологических продуктов, которые могут точно идентифицировать целевые клетки с помощью антител и высвобождать ассоциированные микромолекулярные препараты после проникновения в клетки - мишени с помощью внутреннего проглатывания для достижения цели точного уничтожения целевых клеток и минимизации убийства нормальных клеток. Благодаря принципам проектирования ADC, он был изображен как « биологическая ракета», начиная с 2000 года, первый препарат ADC Mylotarg ® (gemtuzumab ozogamicin) После одобрения FDA [1], по состоянию на июнь 2025 года, 19 ADC по всему миру были одобрены для листинга. С тех пор как в 2023 году общий объем продаж ADC в мире впервые превысил 10 миллиардов долларов, в 2024 году общий объем продаж ADC по всему миру продолжает превышать 10 миллиардов долларов, сохраняя сильный рост.

В первой десятке ADC по объему продаж в 2024 году второе место занимает KADCYLA производства Roche (Enmero Tosu, Hesselley). Препарат был одобрен FDA в 2013 году для лечения HER2 - положительного рака молочной железы с глобальным объемом продаж около 2,3 миллиарда долларов в 2024 году. Монорезистент Энмекстоцеллюлит - это ADC, нацеленный на HER2, содержащий антропогенный анти - HER2 IgG1 изотопный монореактив, антитело, которое связывается со стабильным соединением серного эфира MCC (4 - [N - малеимидный метил] циклогексан - 1 - карбонатные эфиры) и ингибирующим микротрубчатым препаратом DM1 (производное метамфетамина), молекулярная масса распределена в 147 ~ 158kDa, а соотношение лекарственного средства / моноантидипиранто (drug to antibody, DAR) распределено в среднем 0~ 8, около 3.5 DAR. Из - за сложности его структуры трудно представить его. В этом исследовании мы используем только что опубликованный на ежегодной конференции масс - спектрометрии США (ASMS) в этом году.Масс - спектрометр Excedion Pro Biopharma нового поколенияПолная характеристика KADCYLA свидетельствует о превосходных аналитических возможностях платформы в области биофармацевтики, в частности, функция Electron - transfer / higher - energy collision dissociation, EthcD, которая помогает точно идентифицировать точки сцепления лекарственных средств, а также идентификацию постпереводной модификации (Post - translational modification, PTM).

Применить яркость

Как упоминалось ранее, в этом году было выпущено новое поколение масс - спектрометра Excedion Pro Biopharma со сверхвысоким разрешением 2 - в - 1 для глубокого представления KADCYLA. Изюминки прибора включают, но не ограничиваются, расширенный диапазон контроля качества до m / z = 12000 Da (требуется конфигурация BioPharma option), который позволяет измерять молекулярную массу моноклональных антител мономеров / димеров / тримеров, а также других белковых комплексов макромолекулярной массы в неинвазивных условиях; Выбранная функция ETD обеспечивает быстрое и чувствительное разрушение ETD / EthcD в сочетании с высокоэнергетическим коллапсным разрушением (Higher - energy Collisional Dissociation, HCD), что позволяет получить полное и богатое покрытие последовательностей белков и идентификационную информацию PTM. Структура прибора Excedion Pro Biopharma показана на рисунке 1, где показан процесс глубокого представления KADCYLA в этом эксперименте.

Рисунок 1. Структура Excedion Pro BioPharma, обозначенная синим светом по сравнению с аппаратными обновлениями предыдущего поколения. Выбор BioPharma Edition расширяет диапазон контроля качества до m / z = 12000 Da (зеленый блок), а выбор ETD обеспечивает фрагментацию ETD / EthcD (красный блок). (Нажмите для просмотра большой карты)

Рисунок 2. Схема представления KADCYLA.

(Нажмите для просмотра большой карты)

Нажмите вниз, чтобы увидеть все

Измерение полной молекулярной массы KADCYLA в условиях денатурации

Полная молекулярная масса является неотъемлемой частью характеристик биомедицинских продуктов, и для ADC, помимо полной молекулярной массы, среднее значение DAR и распределение фармацевтической нагрузки (DLD, drug load distribution) также являются ключевыми атрибутами для оценки качества препарата. В этом эксперименте мы провели полное измерение молекулярной массы KADCYLA в неизменных условиях. В условиях денатурации используется нейтральная буферная солевая система, молекулы белка ближе к их естественному состоянию по сравнению с условиями денатурации, а белки менее заряжены в условиях денатурации, меньше перекрываются масс - спектральные пики между соседними зарядовыми состояниями, что уменьшает взаимные помехи между масс - спектральными сигналами и помогает получить более точные результаты измерения полной молекулярной массы. На рисунке 3 показаны результаты измерений полной молекулярной массы в условиях денатурации KADCYLA. Чтобы приблизить образец к естественному состоянию, мы не проводили десахаридизацию. Как видно из рисунка 3A, на уровне исходной спектрограммы, в основном достигается базисное разделение масс - спектральных пиков, связывающих различные количества лекарств и различные компоненты сахарного типа. Распределение лекарственной связи от 0 до 8 может быть четко замечено после свертывания (рисунок 3B). Программное обеспечение BioPharma Finder автоматически вычисляет среднее значение DAR, среднее значение DAR ADC составляет 3,47 (рисунок 3C), что соответствует 3.5, как сообщается в литературе.

а)

В)

с)

Рисунок 3. Результаты измерений полной молекулярной массы KADCYLA в условиях денатурации. A, Исходные и локальные карты. B, Решение сверточной спектральной карты. Программное обеспечение BioPharma Finder позволяет автоматически выбирать соответствующие компоненты и вычислять средние значения DAR. (Нажмите для просмотра большой карты)

Нажмите вниз, чтобы увидеть все

Данные зависят от вторичного разрушения EthcD для анализа пептидных карт,

Достижение перекрестного позиционирования и идентификации PTM

Пептидный анализ, основанный на комбинации жидкостей, является одним из распространенных методов анализа в характеристиках биотерапевтических продуктов, который может обеспечить охват последовательности, позиционирование различных химических модификаций и качественный количественный анализ общих модификаций после перевода. В различных методах масс - спектрального разрушения, поскольку фрагментация HCD может генерировать обильные частицы B / y после прерывания пептидных связей для идентификации пептидного сегмента, она широко используется в пептидном анализе. Однако для некоторых модифицированных пептидных сегментов, таких как гликоптиды, соединители - фармацевтические дипептидные сегменты и т. Д. Поскольку HCD разбивает сахарную цепь / связующее звено - фармацевтическое соединение, использование фрагментации HCD не может точно определить место модификации для пептидных сегментов с несколькими потенциальными точками модификации; Кроме того, для некоторых пептидных сегментов, содержащих изомеризированные аминокислоты, такие как лейцин / изолейцин, аспарагин / аспарагин, изомеризация и т.д., их невозможно отличить из - за одинаковой массы b / y ионов, генерируемых HCD. Из - за различных механизмов реакции ETD может не только полностью сохранить сахарную цепь, соединительные суб - фармацевтические соединения и другие боковые цепные модификации при фрагментации скелета пептидного сегмента, но и производить характерные диагностические ионы для изомеризации аминокислот, чтобы достичь идентификации и дифференциации изомеризированных аминокислот. Добавление дополнительного фрагментации HCD, или EthcD, на основе фрагментации ETD позволяет одновременно получать ионы b / y и c / z в одной и той же вторичной спектроскопии, получая более полную и богатую информацию для реализации характеристик пептидных сегментов, особенно модифицированных / изомеризированных. Масс - спектрометр Excedion Pro со сверхвысоким разрешением 2 в 1 с опцией ETD обеспечивает быстрое и чувствительное разрушение ETD / ETchD, может устанавливать режим сбора данных с зависимым от данных вторичным разрушением EthcD (data dependent EthcD MS2, dd EthcD MS2), который дополняет зависимое от данных вторичное разрушение HCD (dd HCD MS2), чтобы получить полную информацию для анализа пептидных карт.

В этом исследовании мы провели дегенеративное ферментативное решение KADCYLA с использованием протеазы Trypsin и AspN, соответственно, а затем собрали данные DD HCD MS2 и DD EthcD MS2 для двух различных образцов протеазы, чтобы получить информацию о последовательности покрытия, распределении точек сцепления и интерпретации. Образцы, использующие dd HCD MS2, Trypsin и AspN - ферментный анализ, обеспечивают 100 - процентное покрытие последовательности инъекций (данные не показаны). На рисунке 4 показана базовая пиковая спектрограмма (Base Peak Chromatogram, BPC), проанализированная с помощью пептидных карт образцов с использованием DD EthcD MS2, Trypsin и AspN - ферментативного решения, а также последовательность покрытия, которая также обеспечивает 100 - процентное последовательное покрытие образца, что свидетельствует о том, что фрагментация ETD / ETchD с помощью масс - спектрометра Excedion Pro II - I с ультравысоким разрешением совместима с обычной жидкостной хроматографией потока и обеспечивает высококачественный вторичный спектр для анализа пептидных карт.

Рисунок 4. Пептидная карта KADCYLA анализирует базовую пиковую спектрограмму и охват последовательностей в режиме сбора данных dd EtchD MS2. Слева, образец ферментативного решения Трипсина. Справа, образец ферментативного решения AspN. Для различных образцов протеазы может быть достигнуто 100 - процентное последовательное покрытие одной иглы. (Нажмите для просмотра большой карты)

Как упоминалось ранее, соединение KADCYLA - лекарственный препарат (MCC - DM1) связывается с лизином путем ковалентного связывания, а N - конец моносопротивления критозу также связывается, поэтому для всей молекулы KADCYLA существует 92 потенциальных сцепления, из которых 46 не повторяются (рис. 5). Поскольку лизин, связанный ковалентной связью, создает пространственное битовое сопротивление, которое приводит к утечке трипсина, ферментативное разложение трипсина приводит к образованию соединительного сегмента - фармацевтического дипептида, содержащего несколько лизина, в то время как фрагментация HCD одновременно разрушает каркас пептидного сегмента и ассоциированный препарат, что делает невозможным точное определение места сцепления препарата исключительно на основе вторичной спектроскопии HCD. В то время как EthcD из - за различных механизмов разрушения может сохранять лекарственные соединения при фрагментации скелета пептидного сегмента, оптимизированная энергия разрушения HCD может сделать фрагментацию пептидного сегмента более полной, сохраняя при этом до максимума полную связь препарата. В таблице 1 показано вторичное дробление образцов ферментативного разложения Trypsin с использованием HCD и EthcD, соответственно, и обобщение полученной информации о связанных с лекарственными средствами точках, 43 из 46 потенциальных модифицированных участков были идентифицированы как имеющие фармацевтическую модификацию, что свидетельствует о фрагментации с использованием EthcD. Для пептидных сегментов, содержащих несколько потенциальных ассоциированных точек, можно точно определить местоположение сцепления, и в сочетании с результатами HCD можно получить полную и подробную информацию о связанных точках.

Рисунок 5. Все потенциальные модифицированные участки молекулы KADCYLA, отмеченные красным квадратом в последовательности белков, составляют в общей сложности 92 участка, 46 из которых не повторяются.

(Нажмите для просмотра большой карты)

Таблица 1. Сводная информация об идентификационных точках KADCYLA

(Нажмите для просмотра большой карты)

Красный шрифт, перекрестные точки. "+ +", сцепленные точки могут быть подтверждены ионами мусора второй ступени. "+", на этом пептидном сегменте существует сцепление, но конкретное сцепление не может быть подтверждено по ионам мусора. "-", не идентифицирован до сцепления.

Нажмите вниз, чтобы увидеть все

При ферментации KADCYLA с помощью AspN тяжелая цепь производит пептидный сегмент D, содержащий три лизина.К(216)К(217)ВЭПК(221)СC， Кроме того, анализ пептидной карты проб трипсина показывает, что все три лизина могут быть связаны. Подключатель KADCYLA MCC - DM1 - препарат содержит изомерный центр (рисунок 6, слева вверху), что приводит к тому, что сегменты лекарственного дипептида стираются в антифазной хроматографии в виде пиков. Как показано на рисунке 6, пептидный сегмент D существует из - за нескольких потенциальных точек сцепления и центров изомеризации MCC - DM1К(216)К(217)ВЭПК(221)Экстракционная диаграмма потока ионов SC (Extract ion current, XIC) показывает несколько групп пиков. Благодаря информативной вторичной спектроскопии, полученной в результате разрушения EthcD, можно точно определить, какой участок пептида стирается в разное время удержания (рисунок 6 ниже), а относительное соотношение каждой модификации может быть рассчитано на основе пиковой площади XIC (рисунок 6, справа вверху).

Рисунок 6. Идентификация сцепленных участков пептидных сегментов, содержащих несколько сцепленных участков, с помощью EthcD. (Нажмите для просмотра большой карты)

Для образцов ADC, в дополнение к лекарственным сцеплениям, различные постпереводные модификации, связанные с качеством лекарств, также требуют представления и мониторинга. На рисунке 7 показана спектроскопия вторичного разрушения на основе EthcD для пептидного сегмента FNWYVisoД(283)Результаты анализа изомеризации аспарагиновой кислоты компанией GVEVHNAK. Благодаря высокой чувствительности и высококачественной точности приборной платформы, даже если относительное содержание составляет всего 0,18% изомеризированного пептидного сегмента без модифицированных пептидов, можно идентифицировать богатые ионы c / z, а также характерные ионы c + 57 / z - 57, образующиеся изомеризацией аспарагиновой кислоты при разрушении ETD, что позволяет подтвердить изомеризацию аспарагиновой кислоты. Относительно количественные результаты можно получить по другим распространенным постпереводным модификациям, таким как деамидирование, окисление и гликолизация (рис. 8).

Рисунок 7. Использование фрагментации EthcD для подтверждения изомеризации аспарагиновой кислоты. На диаграмме локального усиления ниже можно наблюдать ионы c + 57 / z - 57. (Нажмите для просмотра большой карты)

Рисунок 8. Относительно количественные результаты других распространенных постпереводческих модификаций, все из которых представляют собой три dd EtchD MS2. A, Окисление метилтиона. B, Аспарагин деамид. C, Аспарагин Амберамид. D, Окисление триптофаном. E, Тяжелая цепь N - гликемизация. (Нажмите для просмотра большой карты)

Нажмите вниз, чтобы увидеть все

Резюме

В этой статье представлены результаты экспериментов с использованием нового поколения масс - спектрометра Excedion Pro BioPharma для представления ADC KADCYLA с соединением лизина. Полное молекулярное измерение KADCYLA в недеформированных условиях позволяет измерить распределение количества сцеплений препарата от 0 до 8 без десахаридизации, среднее значение DAR, полученное с помощью программного обеспечения, составляет 3,47, что соответствует отчету 3.5; Быстрое и чувствительное разрушение EthcD может не только обеспечить 100 - процентное последовательное покрытие одной иглы, общую идентификацию модификации после перевода и относительную количественную оценку, но и реализовать идентификацию сцепленных точек, идентификацию изомеризированных аминокислот и т. Д., Чтобы обеспечить достоверные результаты для полного представления сложных биологических молекул.

Ссылки:

[1] Фу, З., Ли, С., Хан, С. и др. Конъюгат антител: биологическая ракета для целевой терапии рака. Sig Transduct Target Ther 7, 93 (2022).

[2] https://assets.roche.com/f/176343/x/38d96ed8ec/fb24e.pdf

Joubert, N., Beck, A., Dumontet, C., Denevault-Sabourin, C. Антитела-лекарственные конюгаты: последнее десятилетие. Фармацевтика 2020, 13, 245.

Если вам нужно сотрудничество для воспроизведения этой статьи, пожалуйста, оставьте сообщение в конце текста.