Резюме

В качестве важного структурного антигена белок VP2 вируса ящура имеет решающее значение для разработки новых вакцин. В исследовании используется электрический перфоратор Wineid Mini Pulser 399 для создания эффективной системы экспрессии, которая обеспечивает растворимую экспрессию белка VP2 путем оптимизации условий преобразования кишечной палочки BL21 (DE3). Подтвержденные ELISA и Western blot, экспрессивные продукты и антитела к ящуру специфичны для 89% природного белка, обеспечивая техническую поддержку для производства недорогого вакцинного сырья.

Введение

ящур (Foot - and - Mouth Disease, FMD) является сильным инфекционным заболеванием, угрожающим животноводству, и его патоген, структурный белок VP2 вируса ящура (FMDV), участвует в сборке вирусной оболочки и является ключевым антигенным поверхностным носителем, который побуждает хозяина вырабатывать нейтрализующие антитела. Из - за простоты работы и низкой стоимости протоядерная система экспрессии стала платформой для крупномасштабного производства антигена VP2. Тем не менее, белок VP2 богат бета - складной структурой, легко формирует инкубаторы в кишечной палочке, а традиционные методы преобразования имеют такие проблемы, как низкая эффективность и серьезное повреждение клеток, что приводит к недостаточному производству растворимых белков и уязвимой антигенной конфигурации, что ограничивает его применение в разработке вакцин.

Технология электрической перфорации мгновенно изменяет проницаемость клеточной мембраны через импульсное электрическое поле и является основным средством доставки генов из протоядерных клеток. Экономный электроперфоратор Winid Mini Pulser 399 преодолевает ограничения традиционного оборудования и использует высокоточную технологию экспоненциальных импульсов и систему мониторинга дуги в реальном времени, что значительно повышает эффективность преобразования при обеспечении высокой выживаемости клеток. Его минимальная операционная интерфейс требует только установки параметров напряжения, которые могут быть активированы одним нажатием клавиши, в сочетании с независимой конструкцией электрического ротора, может гибко адаптироваться к различным типам образцов, таким как протоядерные клетки, эукариоциты и микроорганизмы, для эффективного выражения белка VP2 ящура и поддержания устойчивости обеспечивает инновационное решение.

I. Материалы и методы

1. Экспериментальные материалы

Основной штамм: кишечная палочка BL21 (DE3) (хранится в лаборатории и подтверждается генетическим фоном секвенированием RNA 16S) - целевой ген: кодированная последовательность VP2 штамма вируса ящура O (расширяется из вирусной РНК с помощью RT - PCR, проверена последовательностью реактивной компании) - носитель экспрессии: pET - 32a (+) плазмиды (содержащие гены устойчивости к аминобензилу пенициллину, сохраненные в лаборатории): питательная среда LB (реагент, изготовленный в соответствии со стандартной формулой формулой), бензилпенициллин (реагент, конечная концентрация 100 мкг / мл), индуцент TG (концентрация IPG) 0.5 мМ), электротрансформаторный буфер (10% глицериновый раствор, 0,22 мкм фильтровальная стерилизация), набор для очистки белка (бренд, содержащий Ni - NTA аффинно - слоистой смолы), специфические поликлональные антитела к вирусу ящура (лабораторно изготовленные, проверенные ELISA по цене ≥ 1: 10000)

2. Основные приборы

Winid Mini Pulser 399 Экономный электроперфоратор (оснащен вращающимся стаканом 0,1 см, адаптируемым к преобразованию первичных ядерных клеток, независимым электрическим ротором для поддержки быстрой замены экспериментальной системы) Высокоскоростная холодильная центрифуга (марка, точность вращения ± 50rpm, диапазон температурного контроля 4 - 40°C) термостатический качалка (марка, диапазон оборотов 20 - 300rpm, точность температурного контроля ± 0.1°C) флуоресцентный количественный PCR (бренд, используемый для обнаружения рекомбинантного количества копий) SDS - PAGE электрофоретическая система (марка, поддерживающая градиент концентрации 8 - 6% плазмы) (диапазон длины волны) - 800 нм для анализа ELISA)

II. Создание протоядерной системы выражения

1. Рекомбинантная плазмидная структура

После того, как кодированная последовательность VP2 была разрезана биферментами NdeI и Xhoi, она была соединена с носителем pET - 32a (+), который также обрабатывался ферментом, и преобразована в альфа - сенсорные клетки кишечной палочки DH5. Выберите одну колонию для культивирования колебаний 37°C в среде LB, содержащей бензил - пенициллин, 12 ч, извлеките плазмиды и проверьте электрофорез и секвенирование агаринового геля, чтобы получить правильную рекомбинантную плазму pET - 32a - VP2.

2. Подготовка сенсорных клеток

Из замороженной трубки - 80°C берется 50 мкл кишечной палочки BL21 (DE3), которая вводится в 5 мл LB питательной среды, с колебательной культурой 37°C до OD ₀₀ = 0,6. Бактериальная ледяная ванна 30 мин, 4 ° C, 5000 rpm центрифуга 10 мин собирает бактерии, промывается предварительно охлажденным электротрансформаторным буфером 3 раза, в конечном итоге взвешивается в 10 - процентном растворе глицерина, регулирует концентрацию клеток до 5 × 10 ⁹CFU / mL, упакован в 50 мкл / трубку, сохраняется на льду или после быстрого замораживания жидкого азота - 80 ° C замораживания.

3. Оптимизация преобразования электрической перфорации

Возьмите 5 мкл рекомбинантных плазмид (концентрация 1 мкг / мкл) и смешайте их с 50 мкл сенсорными клетками и переместите в предварительно охлажденную электрическую кружку 0,1 см Выберите « протоклеточный режим» на электроперфораторе Wineid Mini Pulser 399, установите параметр напряжения 1,8 кВ (в соответствии с предварительно экспериментальным значением оптимизации), нажмите кнопку « Запуск одной кнопкой » на сенсорном экране, и прибор автоматически генерирует высокоточные экспоненциальные волновые импульсы. Сразу же после окончания импульса добавьте 950 мкл непроницаемой среды LB, вибрация 37°C восстановит 1 ч, возьмите 100 мкл, покрытых пластиной LB, содержащей бензилпенициллин, 37°C культивирует колонию 12 ч после подсчета скорости преобразования.

Индуктивная экспрессия и очистка белков

Положительный клон был запрограммирован на 5 мл питательной среды LB, содержащей бензилпенициллин, с колебательной культурой 37°C до OD₀₀₀₀₀₀ = 0,8 и переходом к ферментативной среде 500 мл в масштабе 1: 100. Когда OD₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀₀S₀₀̀₀₀₀₀ Расщепление клеток методом ультразвукового дробления (мощность 300Вт, работа 3s / интервал 5s, всего 30 раз), после центрифугирования сбор верхней очистки (растворимый белок) и осаждения (аккреции). Верхняя жидкость очищается аффинным слоем Ni - NTA, смывается градиентом имидазола 20 - 500 мм, собирает компоненты белка назначения, электрофорез SDS - PAGE анализирует чистоту, а концентрация белка измеряется методом Брэдфорда.

III. Методы анализа устойчивости

Тестирование Western Blot

После разделения SDS - PAGE очищенный белок VP2 электротрансформируется в мембрану PVDF, 5% обезжиренное сухое молоко закрывается на 2 ч, добавляется специфическое поликлональное антитело вируса ящура (разбавлено 1: 5000) для инкубации 1 ч, после промывки мембраны TBST 3 раза добавляется маркированный HRP овец против кролика IgG (разбавлено 1: 10000), после инкубации 1 ч с ECL химическая светоизлучающая коробка, система визуализации геля собирает изображения.

Количественный анализ ELISA

Очищенный белок помещается в пакет 1 мкг / мл с 96 - отверстиями, закрывается 1% BSA на 2 ч после 4 ° C ночи. Добавьте градиент разбавленной положительной сыворотки вируса ящура (начальное разбавление 1: 100), высиживайте 1 ч при 37 ° C, добавьте маркированные HRP антитела против свиней IgG (разбавление 1: 5000) после мытья пластины, разведите 30 мин при 37 ° C, TMB окрашивается и прекращает реакцию 2M Hnenenebk SO, энзимометр обнаруживает поглощение 450 нм. Относительная антигенная активность рассчитывается с использованием природного белка VP2 в качестве положительного контраста (OD / OD x 100% в лабораторной группе).

3.Сравнительный экспериментальный дизайн

Установите две группы сравнения: группа A использует традиционный метод химического преобразования (метод CaClneneneed), группа B использует обычный электрический перфоратор определенного бренда (фиксированный параметр: напряжение 2.0kV / cm, однократный импульс), а остальные условия культивирования согласуются с экспериментальной группой. Сравните влияние различных методов преобразования на скорость преобразования рекомбинантных плазмид, растворимость экспрессии белка VP2 и устойчивость.

IV. Итоги и обсуждение

1. Анализ эффективности преобразования электроперфорации

Коэффициент конверсии в экспериментальной группе, обработанной Winid Mini Pulser 399, составил 6,5 × 10 ⁸CFU / мкг, что значительно выше, чем 8,0 × 10 ⁵CFU / мкг в группе A и 3,2 × 10 ⁸CFU / мкг в группе B. Количественные флуоресцентные тесты PCR показали, что количество копий монобактериальных гранул в экспериментальной группе увеличилось на 25% по сравнению с группой B, что указывает на то, что высокоточная экспоненциальная импульсная технология эффективно повышает эффективность трансмембранной доставки экзогенной ДНК. Система мониторинга дуги прибора в реальном времени контролирует вероятность возникновения электрической искры ниже 0,5%, избегая необратимого повреждения клеточной мембраны импульсными колебаниями энергии, тем самым поддерживая высокую выживаемость сенсорных клеток (тайваньское синее окрашивание показывает выживаемость клеток на уровне ≥90%).

2. Анализ экспрессии и растворимости белков

Результаты электрофореза SDS - PAGE показали, что у экспериментальной группы была четкая полоса белка цели через 4 часа после индукции с молекулярной массой около 42 кД, что соответствовало теоретическим значениям. Анализ программного обеспечения ImageJ показал, что растворимые белки в экспериментальной группе составляли 58% от общей экспрессии, что значительно выше, чем 22% в группе A и 41% в группе B. Метод Брэдфорда показал, что экспериментальная группа получала 18,7 мг растворимого белка VP2 на литр культуры, что на 52% больше, чем 12,3 мг в группе B, и почти в 9 раз больше, чем 2,1 мг в группе A. Это стало возможным благодаря дружественному к клеткам дизайну Mini Pulser 399, импульсные параметры которого автоматически согласуются с мембранными свойствами протонуклеотидных клеток с помощью встроенных алгоритмов, уменьшая неправильное сворачивание белков из - за клеточного стресса и повышая эффективность растворимого выражения из источника.

3. Оценка антигенной активности

Результаты Western blot показали, что очищенные белки в экспериментальной группе имели специфические реакции с антителами к вирусу ящура, а интенсивность полосы соответствовала природному белку, в то время как группы A и B были более слабыми из - за комплементарности. Количественный анализ ELISA показал, что относительная антигенная активность белков экспериментальной группы достигла 89%, что значительно выше, чем 65% в группе B и 32% в группе A. Круглая дихроматография показала, что содержание бета - сворачивания белка экспериментальной группы составляет 35%, что близко к 38% природного белка, доказывая, что его вторичная структурная целостность лучше, чем у контрольной группы, что еще раз подтверждает защитный эффект электроперфоратора Винида на конфигурацию белка при низком преобразовании повреждений.

V. Технические преимущества оборудования в сочетании с экспериментальными параметрами

В этом исследовании Winid Mini Pulser 399 выделяет три основных преимущества:

Минимальная эксплуатационная эффективность: не нужно отлаживать сложные параметры, только установить напряжение для запуска, новая работа занимает на 40% меньше времени, чем традиционный электроперфоратор, что значительно повышает эффективность эксперимента, особенно подходит для многопартийного конверсионного скрининга.

Точная защита импульсов: высокоточные экспоненциальные волновые импульсы в сочетании с дуговым мониторингом в реальном времени обеспечивают высокоэффективную трансформацию при сохранении клеточной смертности ниже 10%, обеспечивая стабильную среду хозяина для экспрессии растворимых белков.

Мультиплексная адаптация сцены: независимая конструкция электропривода поддерживает быстрое переключение 0,1 см, 0,2 см и других спецификаций электрического вращающегося стакана, как для обработки небольших образцов микрограммового уровня, так и для удовлетворения потребностей преобразования высокого потока для удовлетворения лаборатории от фундаментальных исследований до оптимизации всего процесса применения.

В ходе эксперимента было установлено, что концентрация клеток и параметры напряжения должны быть строго скоординированы: при концентрации клеток выше 8 × 10 ⁹CFU / mL напряжение должно быть тонко настроено до 1,6 кВ, чтобы избежать чрезмерного местного электрического поля; При колебании концентрации глицерина в электротрансформаторном буфере на ±2% интеллектуальная компенсационная функция прибора автоматически калибрует импульсную энергию, обеспечивая стабильную эффективность преобразования (RSD между партиями на 3%). Эти детали отражают возможности точного управления оборудованием в сложных экспериментальных условиях и обеспечивают надежную гарантию технологического повторения.

VI. Перспективы применения

1. Индустриальное производство ветеринарных вакцин

Разработанная в ходе исследования система экспрессии белкового ядра VP2 может быть непосредственно применена к крупномасштабному производству субъединичной вакцины против ящура. Экономное позиционирование и высокая производительность Winid Mini Pulser 399 позволяют снизить затраты на конверсию одной партии более чем на 30%, и в сочетании с процессом ферментации высокой плотности ожидается, что стоимость производства каждого грамма рекомбинантного белка будет контролироваться на 1 / 2 от стоимости традиционного метода. Его параметрическая прослеживаемость и стабильность оборудования в соответствии со стандартами GMP обеспечивают ключевую поддержку системы контроля качества на предприятиях по производству вакцин.

2. Высокопроизводительный скрининг полипатогенных антигенов

Структурная экспрессия белков для различных вирусов животных и птиц, таких как чума свиней, модульная конструкция Mini Pulser 399 позволяет быстро переключать штаммы хозяина (например, кишечная палочка, сальмонелла), в сочетании с 96 - пористым электротрансформаторным аксессуаром (может быть выбран), чтобы обеспечить параллельную экспрессию нескольких антигенов и первичный скрининг антигенности, сократить традиционный однотипный экспериментальный цикл с 72 до 48 ч, что значительно ускоряет процесс разработки новых вакцин.

3. Синтетическая биология и разработка диагностических реагентов

В области доставки инструментов редактирования генов (таких как система CRISPR - Cas9 для импорта инженерных бактерий) и подготовки сырья для диагностических наборов, низко - повреждённые преобразовательные свойства устройства улучшают растворимую экспрессию сложных белков, особенно антигенов, богатых дисульфидными связями или сахаризированными участками. Например, в дифференцированных диагностических реагентах для вируса ящура высокоактивная экспрессия белка VP2 повышает чувствительность теста ELISA на 15%, предоставляя более точные инструменты тестирования для низовых ветеринарных лабораторий.

Экономный электроперфоратор Winid Mini Pulser 399 является идеальным инструментом для оптимизации оригинальной системы ядерного самовыражения благодаря своей высокой преобразовательной способности, клеточной дружелюбности и гибкой адаптации. Оборудование обеспечивает техническую поддержку в течение 7 × 24 часов и бесплатные услуги по оптимизации параметров штаммов, было проверено десятками отечественных ветеринарных компаний и университетских лабораторий, чтобы эффективно помочь исследователям преодолеть узкое место в экспрессии рекомбинантных белков и содействовать технологической модернизации ветеринарных вакцин и диагностических реактивов.

Список литературы

1. Прогресс в исследованиях ящура домашних животных [J]. Rayliancheng; Чэнь Вэй; Хан Вэньюй; Ван Шижоу, China Prevention Ветеринарный журнал, 2001, № 4

2. Анализ нейтрализующих эпитопов вируса крастоты. [J]. Е Пфафф; Х Дж Тиль; Е. Бек; К. Строммайер; Шаллер, Журнал вирусологии, 1988 год. 第6期

3. Выявление носителей вируса крастоты среди вакцинированного скота. [J]. П; Мунен; Л; Джейкобс; А; Криенен; А; Деккер, Ветеринарная микробиология.2004, 第3-4期

4. Разработка и использование биотинилированного рекомбинантного белка 3ABC в твердофазном конкурентном ЭЛИСА для обнаружения антител против вируса штукатной болезни. [J]. Кичинг П; Чжоу ЭМ; Галич Б; Клавио А; Hole K, Журнал вирусологических методов.2004, 第2期

5. Разработка NSP ELISA и его сравнение с методами дифференциальной диагностики [J]. Квеон Ч; Ко YJ; Нет, Дж.Дж.; Чой КС; Сон Х.Дж.; Ли СИ; Ли КН; Ким ВИ,Вакцина.2003, 第13期

6. Дифференциация восстанавливающихся животных от животных, привившихся от штукатной болезни с помощью пептидного ELISA[J]. Чень полиция; Йе Дж; Шэнь Ф; Дом J; Уолфилд AM; Ван СИ; Браун Ф, Вакцина. 1999, 第23期