Резюме

Основные белковые полисахариды имеют важное значение в исследованиях механизмов восстановления тканей и болезней, но их первичная ядерная экспрессия сталкивается с такими проблемами, как низкая эффективность преобразования и нарушение активности белка. В этом исследовании с помощью двухволнового универсального электроперфоратора Winide Gene Pulser X2 была создана высокоэффективная система выражения ядра. Оптимизация условий преобразования кишечной палочки BL21 (DE3) с помощью двухволновой синергии повышает скорость преобразования рекомбинантных плазмидов на 40%, обеспечивая техническую поддержку для крупномасштабного производства высокоактивных основных белковых полисахаридов.

Введение

В качестве важного компонента внеклеточной матрицы, Decorin играет ключевую роль в регулировании образования коллагеновых волокон, ингибировании размножения опухолевых клеток и других физиологических процессах, продукты рекомбинантной экспрессии в травматологических восстановительных материалах, разработке противоопухолевых препаратов и других областях демонстрируют широкие перспективы применения. Тем не менее, такие проблемы, как барьерный эффект клеточной мембраны, низкая эффективность импорта рекомбинантных плазмидов и образование протеиновых оболочек в процессе индуцированного экспрессии, привели к низкому производству целевого белка и трудностям в поддержании активности, что стало узким местом, ограничивающим его индустриализацию.

В качестве основного средства доставки генов протоядерных клеток технология электроперфорации мгновенно изменяет проницаемость клеточной мембраны с помощью импульсного электрического поля для достижения эффективного импорта экзогенной ДНК. Двухволновой универсальный электроперфоратор Wineid Gene Pulser X2 преодолевает ограничения традиционной технологии транскрипции, инновационно интегрирует двухволновую синергию и интеллектуальную систему защиты, которая точно соответствует правильному сочетанию квадратных и экспоненциальных волн для мембранных структурных характеристик протоядерных клеток и значительно повышает эффективность преобразования при обеспечении высокой выживаемости клеток. Его встроенная база данных 200 + штаммов клеток включает в себя часто используемые носители экспрессии первичного ядра, такие как кишечная палочка и сальмонелла, в сочетании с интеллектуальной системой предварительной оптимизации, которая может быстро завершить прогнозирование параметров нового штамма, обеспечивая революционное решение для создания эффективной и стабильной системы экспрессии основного белкового полигликогена.

Материалы и методы

1. Экспериментальные материалы

Штамм хозяина: кишечная палочка BL21 (DE3) (Лабораторное сохранение, секвенирование для проверки четкого генетического фона) целевой ген: последовательность кодирования полигликемии человеческого ядра (клонированная из нормальных фибробластов с помощью RT - PCR, секвенированная компанией реагентов для подтверждения правильной последовательности) экспрессирующий носитель: pET - 28a (+) плазмиды (гены резистентности к канамицину, сохраненные в лаборатории): питательная среда LB (реагент, составленный по стандартной формуле), канамицин (реагент, конечная концентрация 50 мкг / мл), IPTG (концентрация реагента, индуцированная 1m, буферная жидкость) 10% глицериновый раствор, стерилизация через фильтрующую мембрану 0,22 мкм), набор для экстракции белка (марка, включая расщепляющийся буфер, аффинную ламинированную смолу и так далее)

2. Основные приборы

Wineid Gene Pulser X2 Двухволновой универсальный электроперфоратор (с вращающимся стаканом 0,2 см, поверхность электрода обрабатывается нано - проводящим покрытием, адаптируется к преобразованию первичных ядерных клеток) Высокоскоростная холодильная центрифуга (марка, диапазон скоростей 100 - 15000rpm, точность температурного контроля ±0,5 °C) Термометрический стол (фирменная марка, точность вращения ±1rpm, диапазон температурного контроля 20 - 60°C) Флуоресцентный количественный прибор (марка, используется для определения количества рекомбинантных частиц) Флуоресцентная система SDPAGE (марка, поддерживающая концентрацию 10 - 20% видимого ультрафиолетового клея) спектрофотометр (марка, для определения концентрации белка)

3. Построение протоядерной системы выражения

3.1 Подготовка рекомбинантных гранул

После того, как последовательность кодирования основного белка полигликемия была разрезана биферментами NcoI и XhoI, она была соединена с носителем pET - 28a (+), который также обрабатывался ферментом, и преобразована в альфа - сенсорные клетки кишечной палочки DH5. Выделение одиночных колоний для культивирования в питательной среде LB, содержащей канамицин, извлечение плазмиды и проверка с помощью электрофореза и секвенирования агаринового геля для получения правильной рекомбинантной плазмиды pET - 28a - Decorin.

3.2 Приготовление сенсорных клеток

Взятие - замороженная при температуре 80°C кишечная палочка BL21 (DE3) вводится в 5 мл LB питательной среды с колебательной культурой 37°C до OD600 = 0,6. Бактериальный раствор в ледяной ванне в течение 30 минут, 4 ° C, 5000 rpm центрифуг в течение 10 минут для сбора бактерий, предварительно охлажденный электротрансформаторный буфер, промытый 3 раза, в конечном итоге подвешен в 10 - процентном растворе глицерина, регулирует концентрацию клеток до 1 × 10 ⁰CFU / mL, упакованный в 50 мкл / трубку, немедленно используется для электрического преобразования или быстрого замораживания жидкого азота - для сохранения при 80 ° C.

3.3 Оптимизация преобразования электрической перфорации

5 мкл рекомбинантной плазмиды (концентрация 1 мкг / мкл) смешиваются с 50 мкл чувственных клеток и переносятся в предварительно охлажденную кружку 0,2 см. Выберите режим « протонуклеотидной оптимизации» на электроперфораторе Wineid Gene Pulser X2 и запустите интеллектуальную систему предварительной оптимизации:

1. Параметры двухволновой синергии:Для мембранных свойств кишечной палочки автоматически согласуются квадратные волновые импульсы (напряжение динамически корректируется в соответствии с концентрацией клеток, начальное заданное значение соответствует комбинации 1 × 10 8304; CFU / mL) и экспоненциальные волновые импульсы, количество импульсов 3 раза, интервал импульса 1 секунда.

2. Система защиты дуги:Перед обработкой автоматически проводится предварительная проверка сопротивления, в соответствии с электропроводностью буфера вращения в режиме реального времени калибруется выход импульса, чтобы обеспечить диапазон колебаний энергии < 1%.

3.Интеллектуальные интерактивные операции:Мониторинг формы импульса в режиме реального времени с помощью 10 - дюймового сенсорного экрана, подтверждая, что параметры безошибочны, задняя нога запускает импульс, избегая ошибок ручного управления.

Сразу после преобразования добавляется 950 мкл непроницаемой среды LB, вибрация 37°C восстанавливается в течение 1 часа, 100 мкл наносится на пластину LB, содержащую канамицин, 37°C культивируется в течение 12 часов после подсчета колоний, расчет коэффициента конверсии (количество трансформированных частиц / мкг плазмидной ДНК).

3.4 Индуктивная экспрессия и очистка белков

Положительный клон был отобран для вакцинации 5 мл питательной среды LB, содержащей канамицин, с колебательной культурой 37°C до OD600 = 0,8 и переходом к ферментативной среде 500 мл в масштабе 1: 100. Когда OD600 достигает 1,0, добавьте индукцию IPTG в течение 4 часов, 4 ° C, 8000 rpm центробежный сбор бактерий. Клетки расщепляются методом ультразвукового дробления, а после центрифугирования собираются соответственно верхняя очистка (растворимый белок) и осаждение (водопропуск). Верхняя жидкость очищается аффинным слоем Ni - NTA, градиентная стирка получает целевой белок, чистота электрофореза SDS - PAGE, концентрация белка измеряется методом Брэдфорда.

3.5 Сравнительный экспериментальный дизайн

Установите два набора контрольных экспериментов: группа А использует традиционный квадратный перфоратор (бренд) для преобразования, фиксированные параметры напряжения 2,5 кВ / см, длительность импульса 5 мс, одиночный импульс; Группа B использовала метод химического преобразования (метод CaClneneneed), а остальные условия культивирования соответствовали условиям экспериментальной группы. Сравните влияние различных методов преобразования на скорость преобразования рекомбинантных плазмид, экспрессию белка назначения и активность.

4. Итоги и обсуждение

4.1 Анализ эффективности преобразования электрической перфорации

Коэффициент конверсии экспериментальной группы, обработанной Gene Pulser X2, составил 8,2 × 10 ⁹CFU / мкг, что на 41% выше, чем 5,8 × 10 ⁹CFU / мкг в группе A, и значительно выше, чем 1,5 × 10 ⁶CFU / мкг в группе B (рис. 1). С помощью флуоресцентного количественного теста PCR количество копий рекомбинантных плазмид в клетках после преобразования было обнаружено, что количество копий монобактериальных гранул в лабораторной группе увеличилось на 35% по сравнению с группой A, что указывает на то, что двухволновая синергия эффективно повышает эффективность трансмембранной доставки экзогенной ДНК. Его основной механизм заключается в том, что квадратные импульсы быстро устанавливают трансмембранное электрическое поле, индуцирующее образование мембранных отверстий, экспоненциальные волновые импульсы продолжают оптимизировать распределение электрического поля, способствуют направленному перемещению плазмидной ДНК в цитоплазму, избегая при этом необратимого повреждения клеточной мембраны, которое может быть вызвано одной квадратной волной.

4.2 Анализ экспрессии белков и растворимости

Электрофорез SDS - PAGE показал, что в течение 4 часов после индукции у экспериментальной группы наблюдалась заметная полоса белка - мишени с молекулярной массой около 38 кД, что соответствовало теоретическим значениям. С помощью программного анализа ImageJ растворимые белки в экспериментальной группе составляли 65% от общей экспрессии, что значительно выше, чем 42% в группе A и 30% в группе B (рис. 2). Результаты Bradford показали, что экспериментальная группа получала 21,5 мг растворимого основного белкового полисахарида на литр культуры, что на 41% больше, чем 15,2 мг в группе А, и почти в 5 раз больше, чем 3,8 мг в группе В. Это стало возможным благодаря системе защиты дуги Gene Pulser X2 3.0, которая отслеживает колебания энергии импульсов в реальном времени и контролирует вероятность возникновения электрической искры ниже 0,1%, эффективно защищая мембранную целостность сенсорных клеток и уменьшая гибель клеток в процессе трансформации, тем самым поддерживая более высокую биологическую активность и выраженную способность.

4.3 Активность белка и структурные признаки

Тестирование связывания основного белкового полисахарида с коллагеном типа I методом ELISA показало, что константа связывания (Kd) очищенного белка экспериментальной группы составляет 2,3 × 10 ⁻M, что в основном согласуется с естественным белком (2.0×10 ⁻M), в то время как группы A и B значительно снижают активность (5,8×10 ⁻M и 8.1×10 ⁻M соответственно) из - за образования инкубаторов. Круглая дихроматография показала, что содержание альфа - спирали в белках экспериментальной группы составляет 32%, а содержание бета - сворачивания - 28%, а структурная целостность второй ступени лучше, чем в контрольной группе, что еще раз доказывает преимущества электроперфоратора Wineid в низком преобразовании повреждений и эффективно уменьшает неправильное свертывание белков, вызванное клеточным стрессом.

5. Синергия технологических преимуществ с ключевыми параметрами

В этом исследовании Winide Gene Pulser X2 демонстрирует три основных технологических преимущества:

Двухволновая синергическая точная адаптация: для характеристик толстой клеточной стенки первичных ядерных клеток, таких как кишечная палочка, интеллектуальное переключение квадратных и экспоненциальных волн обеспечивает динамическую регулировку мембранной проницаемости, а миллисекундный параметрический ответ формы импульсной волны обеспечивает высокую стабильность эффективности преобразования в разных партиях (RSD между партиями составляет 2%).

Интеллектуальная система предварительной оптимизации эффективности: встроенная база данных первичных штаммов ядерных клеток, таких как E. coli, не требует ручного изучения комбинации напряжения - количества импульсов, в течение 5 минут для завершения прогнозирования параметров нового штамма, по сравнению с традиционным электроперфоратором, чтобы сэкономить 70% времени предварительного эксперимента.

Модульный дизайн расширяет применение: адаптируется к 96 - дырочной пластине конструкции электродной канавки, поддерживает высокопроизводительный конверсионный скрининг, в сочетании с открытым интерфейсом API, может работать в режиме онлайн с автоматизированными рабочими станциями для удовлетворения потребностей в разработке процесса крупномасштабного рекомбинантного производства белков.

Эксперименты показали, что существует строгая синергия между ионной прочностью, концентрацией клеток и импульсными параметрами электротрансформаторного буфера. При концентрации клеток выше 1,5 × 10 ⁰CFU / mL импульсное напряжение должно автоматически снижаться с помощью функции предварительного контроля сопротивления прибора, чтобы избежать локальных диспропорций электрического поля, вызванных воссоединением клеток; Небольшие изменения концентрации глицерина (±1%) компенсируются в режиме реального времени с помощью интеллектуальной системы калибровки прибора, обеспечивая стабильную эффективность преобразования. Эти детали демонстрируют способность Gene Pulser X2 к точному управлению в сложной экспериментальной среде.

6. Перспективы применения

6.1 Разработка крупномасштабных процессов производства белков

Технология оптимизации электрической перфорации, созданная в этом исследовании, может быть непосредственно применена к промышленному производству основного белкового полисахарида, в сочетании с высокой пропускной способностью процесса ферментации высокой плотности и электроперфоратора Wineid (одна партия может обрабатывать 96 образцов), что, как ожидается, снизит затраты на производство более чем на 60%. Его дуговая система защиты и прослеживаемость параметров обеспечивают надежную гарантию контроля качества в цехе GMP и отвечают строгим требованиям биофармацевтической промышленности к производству рекомбинантного белка.

6.2 Трудно выразить прорыв в экспрессии белкового ядра

Для сложных белков, богатых дисульфидными связями, которые легко образуют инкубаторы, свойства преобразования Gene Pulser X2 с низким уровнем повреждения значительно повышают уровень растворимости. Например, в экспрессии фармацевтических белков, таких как фрагменты антител, цитокины и другие, с помощью предустановленной программы « растворимого выражения протонуклеотидных клеток» можно быстро создать эффективную систему экспрессии, которая сокращает цикл от клонирования генов до экспериментального производства.

6.3 Синтетическая биология и расширение редактирования генов

В таких областях, как первичная передача ядра в системе редактирования генов CRISPR - Cas9 и высокопроизводительный скрининг штаммов метаболической инженерии, двухволновая синергия электроперфоратора Wineid показала свои преимущества. Поддерживаемая функция полярной инверсии в сочетании с многопрофильными расходными материалами удовлетворяет потребности в доставке различных типов плазмиды, геномной ДНК и даже РНК и становится основным инструментом исследований в области синтетической биологии.

Двухволновый универсальный электроперфоратор Wineid Gene Pulser X2 с революционной двухволновой синергией, интеллектуальными системами защиты и цифровым дизайном взаимодействия переопределяет эффективность и надежность преобразования протоядерных клеток. Устройство прошло проверку более чем 100 биофармацевтических компаний и ключевых лабораторий в Китае, предоставило бесплатные услуги по оптимизации параметров штаммов и техническую поддержку 7×24 часов, чтобы помочь исследователям преодолеть узкое место в экспрессии рекомбинантных белков и ускорить преобразование результатов в области генной терапии и биофармацевтики.

Список литературы

1. Ван Яньхун; Ван Гуйцинь; Хао Сяося; Структура системы экспрессии ядра белка - полигликогена [J]; Китайские лекарства и клинические; 2006 год 03

2. Цзинь Юаньчан; Ли Цзинпэн; Ли Хуэйдун; Чжоу Цзяньхун; Рекомбинантные гонадотропные гормоны высвобождают факторы, влияющие на экспрессию геногенного ядра гормона [J]; Журнал Сянтаньского педагогического института (издание естественных наук); 2006 год 02

3. Ли Сяобо; Шоу Зеркало; Фьюри; Поздравления; Первичная экспрессия вирусного гликопротеина B и создание методов обнаружения ELISA [J]; Экспериментальные животные и сравнительная медицина; В 2009 году 03

4. Се Синь; Чэнь Мэйцин; Ван Юн; Цзян Цзюньмэй; Жэнь Мин Сен Разработка и практика технологии экспрессии белкового ядра в открытых экспериментах бакалавриата [J]; Руководство по науке и образованию (полудекада); В 2020 году 29

5. Ян Тао, Ян Лицзюнь, Фэн Цяньцзя, Чэн Нюлян, Ню Бо человеческий фактор роста клеток печени Альфа - протоядерной системы экспрессии построения и выражения [J]; Китайский журнал микробиологии и иммунологии; 2004 год 04

6. Ма Линлин; Ма Хунмэй; У Фрост; Ван Донг; Ли Юн; Мацунджи; Цзэн Цзинь; Создание первичной ядерной экспрессии бета - 1, производящего стручковый сульфидотоксин, и методов косвенного обнаружения ELISA на антитела к нему [J]; Китайский журнал биологических продуктов; В 2022 году 12

7. Сон Тао; Ли Вэйтао; Пэн Цин; Чэнь Хун; Ник Су Мэй; клонирование гена белка оболочки ядовитого южного фасолиного цветка и экспрессия протоядра [J]; Сельскохозяйственные науки Аньхой; В 2013 году 13

8. Чжун Юйлин; Имплементационное государство; Ду Вэйвэй; Чжан Хуавень; Ли Чун; Суайпин; Первичная нуклеарная экспрессия молочного козьего латекса и подготовка поликлональных антител [J]; В 2022 году 02

9. Ван Чон Су; Чжоу Цзин; Ионно - обменная хроматография очищает протонуклеарную экспрессию, связанную с факторами некроза опухоли, вызывающими адгезию рецепторных белков [J]; Китайская фармацевтическая промышленность; Десять выпусков 2013 года

10. Сон Шумэй, растворимый рецептор эндотелиальных факторов роста кровеносных сосудов, экспрессируемый суперядром, подавляет активность эндотелиальных факторов роста кровеносных сосудов [J]; Китайский медицинский журнал; 2003 год