Фундамент спектрофотометрии и цветовая система

Анализы активности глюкозы оксидазы основаны на реакции Триндера. Используя глюкозу в качестве субстрата, GOD катализирует производство - пероксид - водород, под действием пероксидазы, - пероксид - гидроксид - водород с 4 - аминоэтиленглином и N - этил - N (2 - гидроксил - 3 - сульфонамид) интерметиланиламином (TOOS) для получения фиолетовых красителей. Максимальная длина волны поглощения 555 нм. Активная единица определяется как количество ферментов, необходимых для каталитического получения 1 мкмоль - пероксид - водород в минуту при pH 5.1, 37°С. Обратите внимание, что TOOS более стабилен и хорошо растворим в воде, чем традиционные фенольные красители, которые изменяют поглощение менее чем на 2% в течение 2 часов.

Стандартная кривая и компоненты комплекта

Коммерческие наборы для обнаружения активности GOD обычно включают: буферную жидкость (100 мм ацетата натрия pH 5.1), субстративную жидкость (200 мм глюкозы), цветную смесь (4 - аминоэтипилин 4 мм, TOOS 6 мм, пероксидазу 20 У / мл), стандарт GOD (10 мл замороженного сухого порошка). Во время операции берется образец 100 мкл или стандартный продукт, добавляется 900 мкл предварительно смешанной рабочей жидкости (буферная жидкость: субстрат: явная смесь = 7: 1: 2). Спектрофотометр предварительно настроен на ноль, после инкубации при температуре 37°C 5 минут каждые 1 минуту читает 555 нм поглощения, в течение 5 минут подряд. Расчет активности производится со скоростью изменения абсорбции (дельта А / мин).

Влияние температуры и pH на результат

Оптимальный pH для GOD составляет 5.1, но разные источники (плесень, плесень) различаются. Если pH, указанный в инструкции по комплекту, составляет 5.1 - 5.6, необходимо проверить буфер с помощью pH - метра. При каждом отклонении температуры от 1°C скорость реакции изменяется примерно на 4%. Рекомендуется использовать кронштейны колоритной чашки с циклом водяной ванны, удерживая 37 ± 0,5 °C. Если атмосфера кондиционирования воздуха в лаборатории сильно колеблется, можно перейти на определение конечной точки через 15 минут после инкубации с помощью термостатического маркера, но конечный метод должен убедиться, что субстрата достаточно и реакция завершена (добавление 2 м HCl снижает pH до 2,0).

Удаление помех и разбавление проб

Если образец содержит глюкозу, он накладывается на глюкозу - субстрат в реакционной системе, что приводит к завышенному фону. Решение: образец сначала обесцвечивается через гелевую колонну Sephadex G - 25, или образец пуст (без глюкозы). Кроме того, ферменты - пероксид - гидрид в образце потребляют образованный - пероксид - водород, вызывая ложные низкие значения. В реакционную жидкость можно добавлять 1 мм - азид - натрий - ингибирование - пероксид - гидрогеназы примечание - стоп - азот - натрий - токсичность, отходы требуют специального сбора. При обнаружении фермента или клеточного крекинга концентрация белка должна контролироваться на уровне 0,1 - 2 мг / мл, при этом слишком высокая концентрация может подавлять образование пучка. Общий белок может быть измерен методом Брэдфорда, который выражает активность как U / mg белок.