Цветовая система и точность водяной ванны

Фруктоза реагирует с сильной кислотой, образуя производные гидроксиметилфурфурола, которые имеют вишневый красный цвет. Реактор колориметрического метода: 0,1% раствор резорцинола (приготовленный из безводных этанолов), еще 30% соляной кислоты. Операция: взять 1 мл пробного раствора (концентрация фруктозы 5 - 200 мкг / мл), добавить 0,2 мл раствора резорцина и 2 мл 30% соляной кислоты, после смешивания 80 ° C водяной ванны нагревается в течение 10 минут. Температура водяной ванны требует точного контроля: 80±0,5 °C. При повышении температуры до 85°C интерференция глюкозы увеличивается с 1,5% до 8%; При температуре ниже 75°C фруктоза имеет цвет не - полный - полный. После нагрева вода охлаждается в течение 3 минут, измеряется на 480 нм. Стандартная кривая использует анализ чистого фруктозы с концентрацией 20, 50, 80, 140, 200 мкг / мл.

Линейный диапазон и стабильность реагента

Если содержание фруктозы в образце составляет менее 5 мкг / мл (если сок, раствор для разбавления меда), используйте метод связывания гексагиназы - фосфата глюкозы изомера. Принцип: гексогеназа фосфатизирует фруктозу в фруктозу - 6 - фосфатную кислоту, изомера фосфата глюкозы преобразует ее в глюкозу - 6 - фосфатную кислоту, а затем катализирует 6 - фосфат глюкозы дегидрогеназа для получения NADPH, 340 нм тест. Этот метод имеет линейный диапазон 0,1 - 80 мкг / мл. Ферментная смесь должна быть упакована и сохранена при температуре 20°C, рабочая жидкость размораживается перед использованием и заканчивается в течение 2 часов. Активность изомеры фосфата глюкозы должна периодически проверяться: взять известную концентрацию стандартной жидкости фруктозы, измеренное количество NADPH, если оно отклоняется от теоретического значения более чем на 5%, что указывает на инактивацию фермента, необходимо заменить новую партию.

Основа выбора двух методов: помехи матрицы и затраты

Метод резорцинола применим к образцам с высоким содержанием фруктозы и низким содержанием белка, таким как газированные напитки и экстракт грудины. Однако при наличии сахарного тростника гидролиз глюкозы и фруктозы в кислых условиях приводит к высоким результатам. Метод различения: дополнительный образец был взят с использованием ионообменной смолы (Dowex 1×8, тип корня уксусной кислоты) для адсорбции фруктозы, которая не была подвергнута адсорбции для перекисления сахарозы. Ферментный закон имеет сильную специфичность и не подвержен влиянию сахара и глюкозы, но стоимость реагента примерно в 8 раз выше, чем метод цвета. Рекомендуемая колориметрия при обычном лабораторном скрининге; Ферментный метод применяется в тех случаях, когда контроль качества лекарственных средств или научные работы требуют точности.

Выбор цветовой чашки и коррекция пустоты

Длина волны 480 нм находится в зоне синего света, и следует использовать стеклянную колориметрическую чашку (кварц также подходит, но не является необходимым). Коэффициент диаметра света чашки Петри 1 см, перед обнаружением необходимо промыть этанолом - водой (1: 1), а затем смыть деионизированной водой, вытереть наружную стенку. Каждый образец делается пустым реагентом: 1 мл дистиллированной воды вместо жидкости образца, то же самое. В то же время образец пуст: реагент на резорцин не добавляется в жидкость образца, а объем заполняется дистиллированной водой для коррекции цвета самого образца. Окончательная абсорбция = цветовая абсорбция образца - пустая абсорбция образца - пустая абсорбция реагента. Если пустая абсорбция образца превышает 0,1, это означает, что экстракт имеет пигмент и должен быть обесцвечен твердофазной экстракцией C18.