Gal LDH является последним ферментом в пути биосинтеза аскорбиновой кислоты растений (витамин С), катализируя дегидрирование L - галактозида - 1,4 - эндотермина для получения аскорбиновой кислоты. При выборе фермента или набора для его обнаружения необходимо обратить внимание на следующие параметры.

Выбор источника фермента: рекомбинантная экспрессия vs естественная экстракция

Реорганизация Gal LDHА.

Многие из них происходят из системы экспрессии кишечной палочки (часто используемый носитель pET28a). Гигантская горчица Gal LDH (ген At4g33670) является ферментом, зависящим от FAD, молекулярная масса одной полипептидной цепи составляет около 56 кDa. Рекомбинантные белки обычно имеют маркировку His или GST. При выборе обратите внимание:

• Коэффициент активности: очищенный рекомбинантный белок должен быть ≥ 2 U / mg (единица определяется как выработка 1 мкмоль аскорбиновой кислоты в минуту). Менее 0,5 U / mg указывает на частичную инактивацию или недостаточную чистоту белка.

• Удаление меток: если вы планируете провести кристаллографические исследования или производство антител, выберите конструкцию с точкой разреза протеазы TEV. После очистки фиксированного никелевого столба, отсутствие удаления этикетки может нарушить определение активности (маркировка His добавляет пространственное пространственное сопротивление).

Естественное извлечение Gal LDHА.

Очищается от клубники, листьев горчицы или киви. Относительная активность натуральных ферментов обычно 0,1 - 0,5 U / мг, высокая стоимость и большая разница в партиях. Если нет необходимости изучать естественную посттрансляционную модификацию (например, фосфорилирование), предпочтение отдается рекомбинантным ферментам.

II. Ключевые параметры наборов для обнаружения активности

Рецепты Gal LDH основаны на двух принципах тестирования:

Принцип А: прямое определение образования аскорбиновой кислоты

Реакционная система: L - полулактогликозид - 1,4 - эндотермин (1 мм), образец Gal LDH, реакционный буфер (50 мм KHneneneed POnenenebj pH 7.0, 0,2 мм FAD), инкубация при 30°C в течение 20 минут. Добавьте равнообъемный 10% TCA конец, используя HPLC или спектрофотометрию (265 нм) для обнаружения аскорбиновой кислоты. При выборе комплекта требуется наличие L - полулактогликозида - 1,4 - эндотермического субстрата, который трудно синтезировать, чистота в продаже обычно ≥95%. Если субстрат нечистый (содержит L - галактозу или примеси аскорбиновой кислоты), это может привести к высоким значениям пустоты.

Принцип B: Восстановление красителей

Синтез оксидазы аскорбиновой кислоты или обнаружение непосредственно с помощью DCPIP (2,6 - дихлорфенол индигофенола). DCPIP абсорбируется на 600 нм и исчезает после восстановления. Преимущество этого метода заключается в непрерывном мониторинге, но недостатком является нарушение неспецифических восстановителей (таких как GSH, цистеин). Если комплект заявлен как « высокопроизводительный», необходимо проверить наличие антиинтерференционных средств (например, N - этилмалеамид плюс 1 мм на отверстие).

III. Идентификация качества субстрата

L - полулактогликозид - 1,4 - эндотермин является специфическим субстратом Gal LDH, значение K m около 0,5 мм. При выборе субстрата обратите внимание:

• Оптическая чистота: природный субстрат имеет L - конфигурацию. Д - полулактогликозид - 1,4 - эндотермин не идентифицируется этим ферментом. Поставщик должен предоставить отчет об анализе HPLC от руки (e.e. > 98%).

• Стабильность: сухой порошок субстрата может храниться в течение 6 месяцев в условиях сушки - 20°С. Состояние раствора (10 мм в воде) уменьшается примерно на 25% при температуре 4°С в неделю. В случае, если комплект обеспечивает предварительно установленный раствор субстрата, убедитесь, что в него добавлен стабилизатор (например, 0,1% EDTA или 5% этиленгликоля).

• Сравнение цены: каждый грамм субстрата - цена - сетка - низкая - в - $100 (отечественный поставщик) или выше $300 (импортный) должны быть настороже к проблеме примесей. Средняя цена является разумной.

IV. Совместимость вспомогательных факторов с буфером

Галь LDH требует FAD в качестве вспомогательной основы, но большинство рекомбинантных ферментов уже связаны с FAD (при измерении не требуется добавление из внешних источников). Некоторые наборы обеспечивают дополнительный FAD (конечная концентрация 0,2 мм) для восстановления ферментов, которые частично дезинтегрируются. Если измерить тканевый грубый экстракт, эндогенного FAD достаточно. Буфер следует избегать использования триса (при pH 7.0 трис ингибирует активность фермента примерно на 20%), рекомендуется использование фосфата или МОПС.

V. Соответствие типов образцов

Листья растений:: Высокое содержание аскорбиновой кислоты в материале (1 - 5 мг / г свежего веса), интерференция эндогенных продуктов. Приобретенный набор должен содержать PVPP (перекрестный поливинилпирролидон) для удаления полифенолов, а также оксидазу аскорбиновой кислоты для предварительного окисления эндогенной аскорбиновой кислоты. В противном случае фоновая стоимость слишком высока.

Плоды (например, киви, помидоры):: Кислотная среда (pH 3 - 5) вызывает инактивацию ферментов в процессе гомеоплазмы. Набор должен обеспечивать нейтрализующий буфер высокой емкости (1 М Tris - base), который сразу же регулирует pH до 7.0 при выравнивании раствора.

Исцеление тканей или суспензионных клеток:: Состав клеточной стенки прост, достаточно использовать стандартный симметричный раствор. Выбор базового комплекта.

VI. Поток и пределы обнаружения

Метод микропластин рекомендуется для обычного активного скрининга, а метод HPLC используется для проверки и определения динамических параметров.

VII. Требования к данным для контроля качества поставщиков

Комплект должен сопровождаться следующими данными:

1. Положительный контраст (рекомбинантный Gal LDH) Активное значение и допустимый диапазон.

2. Коэффициент изменения абсорбции пустоты (без субстрата) должен быть ниже 10% от общей скорости реакции.

3. Разница между партиями: CV 15% для различных партий субстратов и ферментативных реагентов.

4. Испытание на ингибирование: снижение активности > 90% после добавления известных ингибиторов (например, HgClneneneek 10 мкМ) для проверки специфичности сигнала.

Если поставщик не может предоставить данные о расхождениях между партиями, он может потребовать отправки небольших образцов (содержащих три различные партии субстратов) для самостоятельной проверки.