Биологические реактивы

I. СОДЕРЖАНИЕКомплект реагентов для обнаружения микроорганизмовОсобенности продукции:

(1) Требуется только 1 мкл культивируемой клеточной жидкости и 1 водяная ванна, не требуется извлечения геномной ДНК, не требуется сложное экспериментальное оборудование, такое как флуоресцентная микроскопия, прибор PCR, электрофорез, гелеовизуализатор, биолюминесцентный детектор;

(2) Простой, быстрый и чувствительный метод обнаружения цитоплазмоидов, требующий только 1h результатов;

(3) Для завершения всего эксперимента требуется только одна шаговая операция, результаты эксперимента легко различимы невооруженным глазом в соответствии с изменением цвета реактивной жидкости, без электрофореза, чтобы избежать ложно положительного риска, вызванного многоэтапной операцией с открытой крышкой;

(4) Чувствительность намного выше, чем метод PCR, может обнаруживать различные микоплазмы, обычно встречающиеся в клеточной культуре (носовые микоплазмы свиней, аминокислотные микоплазмы джинга, оральные микоплазмы, холестерины Лай, ферментированные микоплазмы, слюнные микоплазмы, антропогенные микоплазмы, грушевые микоплазмы, на которые приходится 98% загрязнения микоплазмом).

II.Комплект реагентов для обнаружения микроорганизмовСостав (25Т):

III. Этапы эксперимента:

(1) Готовность к высвобождению клеточной питательной жидкости, подлежащей тестированию

При культивировании в течение 2 - 3 дней и оптимальном таянии более 80% клетки берут объем клеточной питательной жидкости более 200 мкл, следуя центрифуге 200 г в течение 5 минут, а затем берут очищающую жидкость для последующего тестирования (не получайте 50 мкл питательной жидкости и осаждения клеток на дне трубки);

(2) Составление реакционной системы (сначала раствор А, раствор В, положительный контраст, парафиновое масло сразу после оттаивания и таяния помещается на лед)

Удалите раствор А от - 20°С, пока он не оттаивается и не растает, слегка перемешайте вверх и вниз вверх и вниз. В микроцентрифуге по количеству образцов клеток, подлежащих измерению, производится следующая система реакции (процесс подготовки реакционной системы очень важен на льду);

Примечание: Для каждого эксперимента требуется 1 отрицательный контроль, 1 положительный контроль и из - за ошибки переноса жидкости в детекторе n образцов обычно рекомендуются для получения N + 3 вышеупомянутых реакционных систем

Слегка перемешивается с помощью генератора и затем распределяется в трубки PCR (рекомендуется использовать трубки PCR объемом 200 мкл), каждая из которых состоит из реакционной жидкости, указанной выше после смешивания;

(3) Верхний образец (весь процесс верхнего образца очень важен для поддержания на льду, особенно парафиновое масло, покрытое выше реактивной жидкости, требует предварительного охлаждения на льду)

Испытуемый образец: добавить 1 мкл в реакторную трубку после центрифугирования, чтобы очистить питательную жидкость, а затем мягко продувать 5 раз с помощью этой жидкостной пушки вверх и вниз;

Отрицательный контроль: не добавлять ни один образец или 1 мкл асептической воды;

Положительный контраст: добавьте 1 мкл положительный контрольный образец, а затем аккуратно продувайте 5 раз этим жидкостным пистолетом вверх и вниз;

Затем над раствором каждой реакторной трубы мягко добавляется 25 мкл парафинового масла (реагирование в водяной ванне), чтобы предотвратить испарение жидкости, которое приводит к неточным результатам. При добавлении парафинового масла обратите внимание на каждую замену головки пистолета, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение между образцами. Если реакция происходит в приборе PCR, парафиновое масло добавлять не нужно.

(4) Реакция

Установите температуру водяной ванны или прибора PCR до 61°C, поместите в реакторную трубку и вылупите 60 мин;

Примечания:

Фактическая температура в водяной ванне может отклоняться от установленной температуры, рекомендуется сначала калибровать с помощью термометра. На самом деле, реакция 59 - 63°C может быть выполнена, но влияет на чувствительность обнаружения;

2Продукты реакции не должны закрываться, иначе образующийся аэрозоль может привести к появлению ложноположительного последующего теста. Реакционные трубы рекомендуется перевязывать в пластиковые пакеты или перчатки, выбрасывать в специальные мусорные баки и своевременно очищать;

Не рекомендуется использовать печь или металлическую ванну для нагрева;

(5) Итоговое суждение

После реакции 61°C 60min немедленно удалите реакторную трубку и поместите ее при комнатной температуре. Наблюдение за реакцией в хорошо освещенной среде (рекомендуется на фоне белой бумаги). Если реакционная жидкость остается сине - фиолетовой, она считается отрицательной; Если реактивная жидкость голубая, она считается положительной.

IV. СООТВЕТСТВУЮЩАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ

1, ShiyuHe, YanzhiHuang, YanlingZhao. AReverseTranscription-PolymeraseSpiralReaction(RT-PSR)-BasedRapidCoxsackievirusA16DetectionMethodandItsApplicationintheClinicalDiagnosisofHand,Foot,andMouthDisease. FrontiersinMicrobiology.2020; 12(11):734-743.

2, Одри Жан, Флоренция Тарди, Омран Аллатив. Оценка микоплазмы загрязнения клеточных культур посредством qPCRusingasetofuniversalprimerpairstargeting1,5kbfragment of 16SrRNAgenes. PLOSONE.2017; 12(2):e0172358.

3、Зохре Сохейли, Мохаммад Сулеймани, Кейван Маджидзаде-Ардебили. Выявление загрязнения клеточной культуры микоплазмой методом изотермальной амплификации с помощью цикла. CellJ.2019; 21(1):43-48.

4, XinXu, XueyuWang, WenHu. Усовершенствованная полимеразная перекрестная спиральная реакция для быстрой диагностики псячего парвовируса 2 инфекции. FrontiersinVeterinaryScience.2020; 7(57):1629-1636.