-
Электронная почта
aoxuelg@vip.163.com
-
Телефон
13601697841
-
Адрес
Хэнфэн - роуд, 218, район Чжабэй, Шанхай
Категории продукта
Шанхайское представительство Британской компании прикладной фотофизики
Высокопроизводительный анализ стабильности белка DSF
ДоговариваемыйОбновление на12/29
- Модель
- Природа производителя
- Производители
- Категория продукта
- Место происхождения
Обзор
Высокопроизводительный анализ устойчивости белка DSF предлагает множество аналитических методов, в дополнение к методу соотношения, SUPR - DSF также предлагает BCM (Barycentric mean, метод усреднения масс - центров), который дает лучшее отношение сигнала к шуму, чем метод соотношения 350 / 330, и в то же время более благоприятен для анализа проб белка с низкой концентрацией.
Подробности о продукте
Стабильность белка
Стабильность белка является одним из ключевых качественных свойств биотехнологических препаратов, которые определяют эффективность, осуществимость производства, безопасность и срок годности биологических препаратов. Высокая структурная стабильность белков гарантирует, что белки остаются активными и безопасными в течение срока их службы.
Исследования стабильности используются для подтверждения устойчивости белка к высокоуровневой структуре HOS (High Order Structure) в различных условиях, таких как температура, pH, состав добавок и время хранения, чтобы определить подходящие условия хранения и транспортировки. В то же время регулирующие органы, такие как FDA и EMA, также требуют обширных данных о стабильности, прежде чем санкционировать использование биологических препаратов. Таким образом, понимание и обеспечение высокой структурной стабильности терапевтических белковых препаратов является необходимым условием для биофармацевтических компаний для разработки безопасных и эффективных лекарств, и исследователи должны анализировать и оценивать высокую структурную стабильность белков на нескольких этапах исследований и разработок и производства.
Общие методы анализа стабильности белка
Анализ стабильности белка обычно проводится с использованием следующих методов:
Биохимический метод
Циркулярная дихроматография (CD, Circular Dichroism Spectroscopy)
Дифференциальный сканирующий термометрический метод (DSC)
Количественная технология PCR (qPCR) (внешний флуоресцентный DSF)
Методы динамического рассеяния света (DLS) и статического рассеяния света (SLS)
Дифференциальный сканирующий термометрический метод (DSC) часто используется в качестве наиболее важного решения для анализа стабильности белка, но потребность в быстром анализе большого количества образцов, хранящихся на микропористой пластине (например, 96 или 384), ограничивает применение DSC в скрининге лекарств и ранней разработке. Таким образом, DSF (метод флуоресценции внутренних источников) стал популярным и экономически эффективным решением.
DSF (метод флуоресценции эндогенных источников) без каких - либо маркировок для измеренных образцов или использования флуоресцентных зондов позволяет быстро измерять микропористые пластины для всего образца и предоставлять данные с высоким потоком, чтобы помочь в отборе кандидатов на образцы и ингредиентов формулы.
Быстрый скрининг большого количества образцов методом DSF значительно повышает эффективность скрининга лекарств и анализа фармакогенности, а результаты анализа и технология DSC взаимно ортогонально проверяются. Для многих биотехнологических препаратов использование метода DSF в качестве быстрого массового скрининга и использование технологии DSC для ортогональной проверки результатов раннего скрининга DSF является эффективной программой скрининга лекарств и разработки лекарств.
Технические принципы DSF:
Дифференциальная сканирующая флуоресценция (DSF) является экономически эффективной и простой в использовании биофизической технологией, которая определяет температуру денатурации белка (Tm или Cm химической денатурации) путем обнаружения соответствующих изменений в спектре флуоресцентного излучения при повышении температуры или присутствии дегенератора.
Исследование показало, что ароматические циклические аминокислоты в белковых молекулах смещаются в максимальном спектре излучения возбужденной внутренней флуоресценции, когда они находятся в микросреде с различными полярными свойствами (например, в гидрофобной или гидрофильной среде). Внутренняя флуоресценция белка в основном происходит из ароматических циклических аминокислот, таких как триптофан (Trp), фенилаланин (Phe) и тирозин (Tyr), из которых внутренняя флуоресценция триптофана сильна.
В случае триптофана максимальная длина волны излучения внутренней флуоресценции составляет около 330 нм в микросреде ядра белка, а в гидрофильной полярной микросреде максимальная длина волны излучения внутренней флуоресценции триптофана составляет около 350 нм. Теплодегенерация или химическая дегенерация белка обычно приводит к изменению полярности микросреды вокруг остатков триптофана, в результате чего триптофан, обычно зарытый в гидрофобном ядре белка, постепенно подвергается воздействию гидрофильной среды, что приводит к красному смещению максимальной длины волны флуоресценции внутреннего источника (Red Shift), то есть к перемещению в большую область длины волны.
Этот метод мониторинга флуоресцентных изменений эндогенных источников триптофана не требует флуоресцентных зондов или меток, что позволяет избежать ложных положительных результатов, таких как фоновая флуоресценция и неспецифическая адсорбция в традиционных экзогенных флуоресцентных DSF.
Когда белки сворачиваются из - за термодегенерации или химических дегенераторов, таких как гуанидин соляной кислоты, мочевина и т. Д. Измерение внутренней флуоресценции с изменением температуры или дегенератора может исследовать процесс разложения белка. Данные об этих изменениях могут быть использованы для создания кривых плавления и получения значений Тм кажущейся температуры термического перехода, Tonset、 Вариация энтальпии Ван дер Ваальта (дельта H), свободная энергия Гиббса (дельта G) и химически дегенеративные значения Cm используются для оценки и прогнозирования стабильности белка.
Традиционные DSF часто используют метод соотношения 350 / 330 для анализа данных, в то время как SUPR - DSF предлагает множество аналитических методов, в дополнение к методу соотношения, SUPR - DSF также предлагает BCM (Barycentric, метод усреднения масс - центров), который дает лучшее отношение сигнала и шума, чем метод соотношения 350 / 330, и в то же время более благоприятен для анализа проб белка с низкой концентрацией.
Основные характеристики системы DSF для анализа стабильности белка высокого потока:
Использование стандартной 384 микропористой пластины без специальных расходных материалов и капилляров
Высокопроизводительный скрининг, процесс нагрева (60 - 80 минут) может быть завершен
Тестирование одной 384 микропористой пластины с использованием эндогенной флуоресценции без красителей или меток, совместимой с обычным биосистемным УФ - светодиодным возбуждением с полным спектральным обнаружением
Требуется только 10 - 30 мкл образцов с концентрацией 0,05 ~ 250 мг / мл
Получение ключевых параметров: Tonset, Tm, дельта -, дельта - G, Cm и сродство и т.д.
Обеспечение высокого качества и воспроизводимости данных
Применение системы SUPR - DSF:
Система SUPR - DSF широко используется во многих областях, таких как фундаментальные исследования в области наук о жизни и разработки лекарств:
Ускорить фильтрацию мутантов
Отбор и оптимизация формул и предварительных формул
Условия кристаллизации белков
Оценка согласованности между партиями
Оценка биосходства
Исследования ускоренного напряжения и принудительной деградации
Комбинированный анализ конфигурационных изменений
Оценка после перевода
Анализ постоянной температуры и химической стабильности
Технические характеристики высокопроизводительной системы анализа устойчивости белка DSF:
Типичный случай применения -Ускорить фильтрацию мутантов
С помощью SUPR - DSF было проведено сравнение и скрининг 16 образцов, в том числе 1 дикого белка (WT) и 15 одноточечных мутантов. В течение 1,5 часов приборы DSF генерировали кривые плавления высокого качества из 48 образцов (по три повторения в каждом наборе) (до 384 отверстий данных за одно и то же время). Данные сопоставляются с помощью модели, которая позволяет получить значение Тм температуры плавления и сортировать и фильтровать стабильность.
Как показано на рисунке 1, кривая плавления трех из этих мутантов (9, 13 и 14) смещается влево по сравнению с WT (синий), что указывает на снижение их белковой стабильности; Стабильность остальных 12 мутантов повысилась. Наибольшее повышение стабильности наблюдалось у мутантов 1, 8 и 12.
На рисунке 2 показаны кривые плавления нескольких репрезентативных образцов, которые показывают, что у некоторых белков происходит один термический переход (WT - белок и мутанты 7 и 8), в то время как у других (мутанты 1 и 14) отчетливо видны два тепловых перехода, а именно две точки перегиба на кривой плавления. Данные, предоставленные SUPR - DSF, могут помочь исследователям отобрать перспективных кандидатов для углубленного изучения.
Точный анализ области Fab моносопротивления
С помощью SUPR - DSF были получены данные дифференциальной сканирующей флуоресценции NISTmAb (стандарт моносопротивления NIST) и сопоставлены результаты с данными, полученными методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). SUPR - DSF может анализировать все три структурных поля NISTmAb: CH2 (69°C), CH3 (83°C) и область Fab (94°C). Максимальная температура сканирования SUPR - DSF составляет 105 °C, что позволяет точно измерять температуру плавления в аномально стабильной области Fab, в то время как максимальная температура сканирования на других платформах DSF, как правило, составляет всего 95°C, что позволяет легко терять важную информацию о конверсионной дегенерации монореактивной области Fab (рисунок 5 (a)).
Данные SUPR - DSF сравниваются с результатами DSC. Как показано на рисунке 5 (b), три пика соответствуют друг другу, демонстрируя хорошую согласованность между двумя методами, и использование SUPR - DSF позволяет легко получить высококачественную информацию о стабильности белка.
Типичный случай применения - ускоренный отбор добавок и формул для моносопротивления
Формула биотерапевтических препаратов, таких как антитела, является основой для обеспечения эффективности, жизнеспособности и безопасности, а также определяет условия хранения и транспортировки. Фармацевтические компании остро нуждаются в методах с высоким потоком для быстрого и надежного скрининга большого количества комбинаций условий для определения оптимальной формулы.
Используя SUPR - DSF, исследователи проверили и проанализировали устойчивость терапевтического монорезистентности к антителам в 96 различных условиях и завершили тест в течение 1,5 часов. Результаты испытаний очень согласуются с результатами дифференциального сканирования теплового метода (DSC). Если интегрировать автоматизированные лабораторные устройства, то можно будет проводить скрининг тысяч образцов в день.
Кривая плавления DSF показывает две отдельные области трансформации, где данные согласуются методом наименьших квадратов, что позволяет определить значения Tonset, Tm и энтальпии Ван дер Ваальта (H.). На рисунке 3 (a, b) показаны кривые плавления и диаграммы соответствия добавок, которые разрушают / повышают стабильность, соответственно. На рисунке 4 (a) перечислены все добавки, способные повысить стабильность антител (по сравнению с контрольными образцами).
SUPR - DSF правильно определил стабилизирующее действие добавочных гистаминов и водорослей, используемых в моносопротивлении критозу, который уже доступен на рынке, и, как показано на рисунке 4 (b), данные SUPRDSF обладают отличной надежностью и последовательностью, обеспечивая при этом удивительно высокий поток.
Получение параметров сцепления с помощью флуоресценции с дифференциальным сканированием высокого потока
Сочетание аналитических исследований является ключевой областью исследований и разработок в области лекарственных средств, а характеристики взаимодействия и значения KD (константы диссоциативного равновесия, характеризующие сродство межмолекулярных связей) имеют решающее значение для выбора кандидатов, и исследователям необходимо использовать различные взаимодополняющие методы для отбора и определения тысяч - десятков тысяч мелких молекулярных соединений в библиотеке.
Анализ молекулярных взаимодействий с помощью SUPR - DSF, не зависящий от таких факторов, как поверхностные эффекты, перенос вещества (mass transport) или проблема скорости преломления буфера, обеспечивает измерения высокого потока без маркировки в диапазоне концентраций связывания анализируемого вещества.
Обнаруживая изменения стабильности белково - рецепторных комплексов, их можно использовать для подтверждения специфичности связывания; Значение КД может быть рассчитано с помощью функциональной зависимости между изменением спектра флуоресцентного излучения при термодегенерации и концентрацией состава. Даже для очень слабых связывающих молекул изменения стабильности, вызванные связыванием, могут быть обнаружены SUPR - DSF.
Используя стандартную 384 - микропористую пластину, можно просеивать тысячи образцов в течение дня, чтобы подтвердить состояние связывания.
Используя SUPR - DSF для изучения связывания рецептора (TFMSA) с ангидридазой I карбоната человека, кривая плавления карбоната ангидридазы с концентрацией TFMSA показана на рисунке 6.
На рисунке 7 показана связь между значением Tm ангидрида карбоната I человека и концентрацией TFMSA, при этом получены два значения KD: 2,1 мкм и 174,2 мкм, соответственно.
Значения в литературе совпадают, доказывая, что SUPR - DSF может быть использован в качестве инструмента предварительного скрининга или подтверждения для исследований связывания рецепторов и обладает чувствительностью.
Простое и интуитивное программное обеспечение
Программное обеспечение SUPR - DSF обеспечивает интуитивно понятный, простой, интеллектуальный и эффективный экспериментальный дизайн и анализ данных, что позволяет новичкам быстро начать работу и предлагает множество передовых вариантов для опытных и опытных пользователей.
О компании ProteinStable
Дочерняя компания Applied Photophysics стремится внедрить клиентоориентированные технологии на рынок белкового скрининга и представления, уделяя особое внимание высокопоточным и низкопробным методам представления белка, которые повышают производительность без ущерба для качества данных.
О компании AppliedPhotophysics
Британская компания Applied Photophysics уже несколько десятилетий предлагает специализированные программы по изучению структуры и функций биологических препаратов, в том числе круговой двухцветный CD - спектрометр, анализатор динамики реакции стоппадного потока, анализатор стабильности белка SUPR DSF.
И так далее. Пользователями являются крупные университеты и научно - исследовательские институты, а также фармацевтические компании по всему миру.
Круглый двухцветный CD - спектрометр серии Chirascan широко используется в расширенных структурных характеристиках биологических препаратов, таких как белки, включая вторичную структуру белков, трехуровневый структурный анализ и исследования тепловой стабильности вторичной структуры и трехуровневой структуры.
Похожий продукт рекомендовать
