Лазерный конфокальный микроскоп Leica

Лазерный конфокальный микроскоп TCS SP8 DLS сочетает в себе преимущества двух систем визуализации: с помощью Leica TCS SP8 DLS (цифровой фотоснимок) вы можете использовать гибкое одноплоское освещение на микроскопе для достижения общей фокусировки. Разработав светоотражатель TwinFlect, мы смогли превратить платформу с общей фокусировкой Leica TCS SP8 в простой и простой в использовании многофункциональный микроскоп с оптическими пластинами.

Лазерный конфокальный микроскоп Leica (например, Leica SP8, серия Stellaris) - это трехмерная система визуализации с высоким разрешением, которая широко используется в биомедицине, материаловедении и других областях. Его операции должны сочетаться с оптическими, лазерными методами управления и обработки изображений, а вот подробное руководство по эксплуатации:

I. ПОДГОТОВКА К ОПЕРАЦИИ

1. Инспекция окружающей среды и оборудования

Экологические требования:

Отдельные темные камеры или затененные среды, чтобы избежать внешнего света, мешающего флуоресцентным сигналам.

Температура контролируется при 20–25 °C, влажность составляет 60%, чтобы предотвратить росу объектива или неисправность цепи.

Проверка оборудования:

Подтвердите, что индикатор состояния лазера (например, 405 нм, 488 нм, 561 нм, 633 нм) в норме (зеленый готов).

Проверьте, чисты ли объективы (например, 10x / 0.3, 20x / 0.75, 63x / 1.4 масляные зеркала) и плавно ли перемещается несущая платформа.

Включите систему охлаждения (например, лазерный водяной охладитель), чтобы обеспечить стабильность температуры на заданном значении (обычно 18 - 22 °C).

2. Подготовка образцов

Биологические образцы:

Живые клетки должны культивироваться в специальных чашках Петри с общей фокусировкой (например, Lab - Tek II), избегая использования обычных бобов, которые вызывают трудности фокусировки.

Фиксированные тканевые срезы должны быть покрыты антифлуоресцентными прокаливающими уплотнителями (например, ProLong Gold) толщиной до 20 мкм.

Образец материала:

Непрозрачные образцы должны быть полированы до шероховатости поверхности ra < 0,1 мкм, а прозрачные образцы (например, полимеры) должны избегать спонтанных флуоресцентных помех.

Требования к маркировке:

Флуоресцентные красители должны соответствовать длине волны лазера (например, DAPI возбуждается 405 нм, а Alexa Fluor 488 - 488 нм).

При многоцветной маркировке убедитесь, что спектр излучения красителя не перекрывается (сигнал может быть разделен с помощью функции разделения спектра).

II. Основные операционные процессы

1. Включение и инициализация

Порядок запуска:

Включите общий источник питания → 2. Запустить лазерную систему охлаждения → 3. Включите микроскоп Хост → 4. Программное обеспечение для управления загрузкой (например, LAS X или Stellaris Suite).

Самопроверка программного обеспечения:

Программное обеспечение автоматически обнаруживает лазеры, сканирующие головки, несущие станции и другие модули, подтверждая статус « Ready».

Выполните функцию « Daily Check», откалибруйте световые пути и чувствительность системы обнаружения (например, усиление PMT, мощность лазера).

2. Определение местоположения и фокусировка образцов

Предварительный просмотр зеркала:

Выберите воздухозеркало 10x, выключите лазер и быстро определите область образца с помощью пропускающего света (например, галогенных ламп).

Перемещение в целевое положение с помощью ручки XY несущего устройства или функции навигации программного обеспечения.

Общая фокусировка:

Включите лазер 488 нм (малой мощности, например 5%), выберите режим "Live" для наблюдения в режиме реального времени.

Регулируйте шаговый двигатель оси Z, постепенно фокусируйтесь с помощью инструмента « Fine Focus», пока флуоресцентный сигнал не будет сильным.

При переключении на объективы с максимальным увеличением (например, масляные зеркала 63x) между объективом и стеклянной крышкой необходимо добавить специальное масло (например, масло Type F).

3. Параметры сбора изображений

Мощность лазера и усиление PMT:

Мощность лазера: постепенно увеличивается с 1%, избегая отбеливания света (обычно не более 20%).

Усиление PMT: настраивается на интенсивность сигнала между 100 - 800 (12 - битное изображение), избегая насыщения (> 4095).

Параметры сканирования:

Разрешение: выберите 512×512 (быстрый предварительный просмотр) или 2048×2048 (высокоточная визуализация) по требованию.

Скорость сканирования: среднее количество линий 1 - 4 (увеличение при большом шуме), среднее количество кадров 1 - 8 (уменьшение при динамическом изображении живых клеток).

Размер игольчатого отверстия: обычно устанавливается как единица 1 Airy (AU), уравновешивающая разрешение и отношение сигнала / шума.

Спектральные параметры:

При многоцветной маркировке спектр излучения образца сканируется в режиме « Lambda Scan», устанавливая диапазон длин волн (например, DAPI: 410 - 480nm, Alexa Fluor 488: 500 - 550nm).

4. Трехмерные изображения и временные ряды

Накладка оси Z:

Установите начальное / конечное положение и шаг (например, 0,5 мкм), программное обеспечение автоматически снимает многослойные изображения и синтезирует 3D - модели.

Временные ряды:

При визуализации живых клеток устанавливаются временные интервалы (например, 1 кадр каждые 30 секунд) и общее количество кадров (например, 100 кадров) для записи динамических процессов.

Включите функцию « Autofocus», чтобы поддерживать стабильность фокуса, избегая перемещения клеток, приводящего к удалению фокуса.

III. Функциональное применение лазерного микроскопа с общей фокусировкой Leica

Режим светового освещения (Light Sheet)

Быстрая низкофототоксичная визуализация для толстых образцов (например, эмбрионов зебры).

Шаги действия:

Переключиться на световой модуль и отрегулировать толщину светового снимка (обычно 2 - 5 мкм).

Установите синхронный сбор с двумя камерами (например, пропускающий свет и флуоресцентные сигналы).

Соедините многоугольные изображения с функцией « Multi - View» и реконструируйте трехмерную структуру.

2. Изображения с гиперразрешением (например, STED)

Преодоление дифракционного предела с разрешением 20 - 50 нм.

Оперативные элементы:

Используйте специальные объективы STED (например, масляные зеркала 100x / 1.4) и лазеры depletion (например, 592 нм).

Корректируйте мощность лазера depletion (обычно 50 - 200 мВт) и режим фазовой маски (например, 2D или 3D STED).

После сбора используется программное обеспечение « Huygens» или « Thunder» для обработки обратной свертки.

Спектральное разделение и линейное свертывание

При разделении перекрывающихся сигналов при многоцветной маркировке:

Получение библиотеки эмиссии образцов в режиме "Lambda Scan".

Загружая спектральные данные в инструмент Spectral Unmixing, программное обеспечение автоматически вычисляет чистые сигналы каждого канала.

Установите порог для удаления фонового шума и сохранения разделенного изображения.

IV. Содержание и техническое обслуживание

1. Повседневная уборка

Оптические элементы:

Используйте воздушный шар, чтобы очистить поверхность объектива, фильтра от пыли и запретить прямое протирание ватными палочками или бумажными полотенцами.

Если требуется очистка, окуните небольшое количество этанола (или специального очищающего средства) в фотобумагу и слегка протрите его спиральным способом.

Стол для погрузки и бункер для проб:

Протрите антистатической тканью, чтобы избежать остаточного выщелачивания или уплотнителя.

2. Обслуживание лазеров

Ограничения использования:

Непрерывная работа не более 8 часов, чтобы избежать повреждения лазерной трубки от перегрева.

При выключении сначала уменьшите мощность лазера до 1%, а затем выключите лазерный переключатель.

Мониторинг продолжительности жизни:

Просмотр оставшегося срока службы в программном интерфейсе « Laser Status» (например, 488 - нм лазер обычно ≥ 20 000 часов).

К концу срока службы свяжитесь с Leica заранее, чтобы заменить лазерную трубку.

3. Периодическая калибровка

Калибровка оптического пути:

Ежеквартально используется стандартная флуоресцентная микросфера (например, TetraSpeck) для калибровки оптической оси и выравнивания отверстий.

Механическая калибровка:

Каждый год проверяется точность оси XY / Z несущей станции (ошибка должна быть < 0,1 мкм), при необходимости корректируются параметры шагового двигателя.

V. Решение общих проблем

Изображение без сигнала

Проверьте, включен ли лазер, имеет ли коэффициент усиления PMT > 0 и соответствует ли фильтр (например, передающий фильтр не блокирует сигнал).

Изображение размыто

Убедитесь, что объектив достаточно пропитан, смещается ли игла, выравнивается ли образец (например, когда выступ живых клеток приводит к отвлечению от фокуса).

Мощность лазера нестабильна.

Очистите окно выхода лазера и проверьте, находится ли температура воды в системе охлаждения в заданном диапазоне (например, ±0,5 °C).

Программное обеспечение Carton

Закройте другие крупные программы, уменьшите разрешение изображения или скорость сканирования или добавьте память компьютера (рекомендуется ≥ 32 ГБ).

Внимание к безопасности микроскопа с лазерной фокусировкой Leica

Лазерная безопасность:

Носите лазерные защитные очки во время работы (длина волны должна покрывать все используемые лазерные линии).

Запрещается смотреть прямо на лазерный луч или отражать свет, избегая длительного воздействия на кожу мощных лазеров (например, > 50 мВт).

Биобезопасность:

При обращении с живыми клетками или патогенами, работайте в шкафу биобезопасности, чтобы предотвратить загрязнение образца.

Химическая безопасность:

При очистке с использованием органических растворителей (например, этанола), работайте в вентиляционном шкафу, избегая вдыхания летучих газов.