PC - 12 дифференцирует клетки феохромоцитомы надпочечников крыс

PC - 12 дифференцирует клетки феохромоцитомы надпочечников крыс

PC - 12 дифференцирует клетки феохромоцитомы надпочечников крысЭто клеточная линия роста стенки, полученная из миелоидной феохромоцитомы надпочечников крыс, которая может быть дифференцирована в нейронные клетки под действием конкретных факторов из - за ее уникальных индуцируемых дифференцирующих характеристик, сохраняя при этом функцию выделения нейротрансмиттеров, стала классической экстракорпоральной моделью для изучения развития нервов, передачи нервных сигналов и восстановления божественных повреждений, что обеспечивает ключевой экспериментальный носитель для фундаментальных исследований в области неврологии и клинической трансформации нейродегенеративных заболеваний.

Основные биологические характеристики

(i) Связь источника с типом клетки

Этот штамм выделяет миелоидную феохромоцитому надпочечников у крыс, и клетки феохромоцитомы естественным образом обладают способностью синтезировать и выделять нейротрансмиттеры катехоламинового типа (такие как норацин, дофамин), которые очень похожи на нейроэндокринные клетки симпатической нервной системы. Клетки PC - 12 имеют эпителиальную форму в недифференцированном состоянии и обладают неограниченной способностью к размножению опухолевых клеток и основными характеристиками нейроэндокринных клеток; В индуцированных условиях нейронные клетки могут дифференцироваться, образуя нервный выступ, с частью структуры и функции нейронов, чтобы стать уникальной моделью, связывающей опухолевые клетки с исследованиями нервных клеток.

(ii) морфологические и дифференцированные характеристики

В недифференцированном состоянии клетки являются многоугольными или эллиптическими, при росте стенки плотно агрегационное распределение, плотное межклеточное соединение, цитоплазма содержит небольшое количество щелочнофильных частиц (частиц, хранящихся в нейротрансмиттерах), ядро имеет круглую форму, ядро очевидно, хроматин распределен равномерно, способность к размножению более сильна, время умножения около 48 - 72 часов.

После индуцированной дифференциации клеточная морфология претерпевает значительные изменения: под действием таких факторов, как фактор роста нерва (NGF), в течение 24 - 48 часов начинают выходить тонкие нервные выступы (длина которых может достигать 5 - 10 раз диаметра клетки), некоторые из которых образуют ветви и соединяются друг с другом, демонстрируя типичные нейронные формы; В цитоплазме увеличивается количество щелочнофильных частиц, нейротрансмиттерный синтез ассоциированных ферментов (например, казената гидроксидаза) выражает повышенные экспрессии, в то же время выражая специфические признаки нейронов (например, нейрофил NF - 200, микротрубчатый связанный белок MAP2), но сохраняет некоторые клеточные характеристики феохромоцитомы (например, секреция катехоламина), образуя уникальный фенотип « нервных клетк».

(3) Молекулярные и функциональные характеристики

На молекулярном уровне клетки PC - 12 обладают нейрореляционными основными молекулярными характеристиками: в недифференцированном состоянии экспрессируют рецепторы нейрофакторов роста (TrkA, p75NTR), которые обеспечивают молекулярную основу для индуцированной дифференциации; После дифференциации ключевые гены нейротрансмиттерного синтетического пути (TH, Dobamin β - гидроксидаза DBH) выражают значительно более высокую экспрессию, а секреция норацина и дофамина увеличивается в 3 - 5 раз по сравнению с недифференцированным состоянием и может быть обнаружена с помощью эффективной жидкостной хроматографии (HPLC); В то же время белки, связанные с передачей нервных сигналов (например, синаптический капсульный белок SV2, синапсин Synapsin I), повышают экспрессию и обладают определенной способностью формировать синаптическую структуру, которая имитирует функцию передачи сигналов нейронов.

Функционально дифференцированные клетки PC - 12 чувствительны к нейротоксичным веществам (таким как 6 - гидроксидофамин, бета - амилоидный амилоид), после воздействия появляются неврологические выпуклости wei - сокращения, клеточный апоптоз и другие проявления повреждения, которые в значительной степени согласуются с патологическими процессами повреждения нейронов и могут использоваться для исследований механизмов повреждения нервов.

Условия экстракорпоральной культуры и дифференциации

(i) Базовые условия культивирования

Приоритет базовой средыиспользоватьRPMI - 1640 Культурные средыДобавьте 10% сыворотки лошади, 5% сыворотки коровьего скота плода (комбинация двойной сыворотки поддерживает способность клеток к размножению и недифференцированное состояние) и 1% антибактериальных реагентов (для предотвращения бактериального загрязнения). Культурная среда должна строго поддерживать 37 °C, 5% CO2B, 95% влажности, колебания концентрации CO2B не более ±0,5%, pH контролируется на уровне 7.2 - 7.4, осмотическое давление 280 - 320 мOsm / kg; Высокая температура (> 39°C) может привести к повышению скорости отмирания клеток, и параметры окружающей среды должны контролироваться в режиме реального времени с помощью датчика инкубатора.

(2) Индуцированные дифференцированные операции

Обычно индукционные факторы являютсяНервный фактор роста (NGF)Конкретные шаги заключаются в следующем:

Кроме того, могут использоваться и другие индуктивные факторы (например, нейротрофические факторы головного мозга BDNF, forskolin), но дифференциация, вызванная NGF, имеет наилучшую повторяемость и является общей схемой дифференциации zui.

(iii) Замораживание и восстановление

При замораживании используется питательная среда RPMI - 1640, содержащая 10% диметилсульфона (DMSO), 20% сыворотки крупного рогатого скота и 10% сыворотки лошади, в качестве замороженной жидкости, концентрация недифференцированных клеток корректируется до 1 × 10 ⁶ - 2 × 10 ⁶cells / ml (дифференцированные клетки легко повреждаются из - за нервных выступов, не рекомендуется замораживать), после установки применяется градиентное охлаждение: 4 °C помещается в течение 30 минут - 20 °C помещается в течение 1 часа - 80 °C на ночь в жидкий азот для долгосрочного

При восстановлении замороженная трубка быстро помещается в водяную ванну 37°C в течение 1 - 2 минут для размораживания, сразу же добавляется в 10 раз больше объема подогреваемой базовой питательной среды разбавления, 1000×g центрифуг в течение 5 минут для удаления DMSO, после повторного подвешивания вводится в питательную бутылку, выживаемость восстановления обычно достигает более 75%. После восстановления необходимо культивировать 2 - 3 поколения, пока клеточная морфология не стабилизируется, а затем дифференцированная индукция, чтобы избежать восстановительного стресса, влияющего на эффективность дифференциации.

III. Основные сценарии экспериментального применения

(I) Исследование механизмов развития и дифференциации нервов

Клетки PC - 12 являются основной моделью нейродифференциальных исследований: они могут анализировать молекулярные механизмы нейротрофических факторов, регулирующих дифференциацию клеток, путем обнаружения активации сигнальных путей TrkA (например, PI3K / AKT, Ras / MAPK) во время индукции NGF; Используя методы генной интерференции (например, siRNA выбивает ген TrkA), наблюдая за формированием клеточных нейронов и изменениями в экспрессии нейронных маркеров, чтобы проверить регулятивное воздействие ключевых генов на дифференциацию; Кроме того, можно изучить влияние эпигенетических модификаций (таких как метилирование ДНК, ацетилирование гистонов) на экспрессию генов, связанных с нейродифференциацией (таких как TH, MAP2), и изучить сети эпигенетического регулирования развития нервов.

ii) Моделирование и исследование механизмов нейродегенеративных заболеваний

Опираясь на чувствительность дифференцированных клеток к нейротоксическим веществам, можно построить экстракорпоральные модели различных нейродегенеративных заболеваний:

С помощью этих моделей можно просеивать потенциальные нейрозащитные препараты, такие как антиоксиданты, противовоспалительные препараты, чтобы оценить их восстановительный эффект на повреждение клеток.

(3) Восстановление неврологических травм и скрининг нейропитательных препаратов

В исследованиях по восстановлению повреждений нервов активность нейротрофических препаратов может быть оценена с помощью модели дифференциации клеток PC - 12: кандидатные препараты (такие как BDNF, нейроджиозид) культивируются вместе с дифференцированными клетками, длина и количество ветвей нейронных выступов наблюдаются через микроскоп, обнаруживается уровень экспрессии нейронных маркеров (таких как MAP2), оценивается стимулирующее действие лекарств на рост нейронов; В модели повреждения нервов in vitro (например, гипоксия, повреждение, вызванное окислительным стрессом), после вмешательства препарата, чтобы проверить выживаемость клеток, высвобождение дегидрогеназы молочной кислоты (LDH) (отражающее степень повреждения клеток), проверить нейрозащитный эффект препарата, обеспечить основу для разработки лекарств для клинического лечения повреждения нервов.

IV. ПРИМЕЧАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ