(Экспериментальные услуги) Количественная флуоресценция в реальном времени PCR

1. Обзор услуг

(Экспериментальные услуги) Количественная флуоресценция в реальном времени PCR(Quantitative Real - time PCR, qPCR) - это метод добавления флуоресцентных групп в систему реакции на усиление PCR, мониторинга всего процесса PCR в реальном времени с помощью накопления флуоресцентных сигналов и, наконец, количественного анализа неизвестных шаблонов с помощью стандартных кривых. Как технология « золотого стандарта» в молекулярных биологических исследованиях, qPCR благодаря своей чувствительности, специфичности и точности стал инструментом для анализа экспрессии генов, обнаружения патогенов и исследований генетических вариаций.

Мы опираемся на платформу для тестирования PCR, чтобы предоставитьЭкстракция образцов нуклеиновых кислот, обратная транскрипция, расширение qPCR для анализа данныхУниверсальное техническое обслуживание. Независимо от того, нужно ли вам проверять уровни экспрессии мРНК, миРНК, lncRNA или проводить анализ вариаций числа копий ДНК (CNV), мы можем предоставить вам высококачественные данные, соответствующие стандартам.

2. Технические принципы и методы

Мы предлагаем две основные стратегии тестирования для удовлетворения различных экспериментальных потребностей:

• Метод SYBR Green I:

• Принцип:Краситель SYBR Green I может специфически связывать небольшие канавы с двухцепочечной ДНК, усиливая флуоресцентный сигнал после соединения. По мере увеличения продуктов PCR усиливается синхронизация флуоресцентных сигналов.

• Применяется:Различия в экспрессии генов начальное сито, крупномасштабное тестирование образцов, чувствительные к стоимости проекты. Мы сотрудничаем с анализом кривой плавления (Melt Curve), чтобы обеспечить единство продуктов амплификации.

• Метод зонда TaqMan:

• Принцип:Используйте специальные зонды, предназначенные для целевой последовательности (5 'концевой маркер флуоресцентной группы отчетности, 3' концевой маркер закалки группы). Когда зонд закончен, он не имеет флуоресценции, и гидролиз фермента Taq во время амплификации отрезает флуоресцентную матрицу и испускает флуоресценцию.

• Применяется:Эксперименты с высокой специфичностью, многократное тестирование PCR (Multiplex PCR), дифференциальное тестирование SNP, микротестирование образцов.

3. Содержание услуг и весь процесс

Мы строго следуем стандартизированным операционным процедурам (SOP), обеспечивая точность и управляемость каждого шага:

Этап 1: Экспериментальное проектирование и оптимизация

• Конструкция экстракта / зонда:Разработка кросс - эндогенных экстрактов для генов назначения (Target Gene), чтобы избежать вмешательства в загрязнение геномной ДНК; Скрининг эндогенов (Housekeeping Gene, например, GAPDH, ACTB, 18S rRNA и т.д.).

• Предварительная экспериментальная проверка:Проверьте специфичность экстракта с помощью обычного электрофореза PCR и агаринового геля, оптимизируйте температуру отжига.

Этап 2: Обработка образцов

• Извлечение нуклеиновой кислоты:Для различных типов образцов (клетки, ткани, кровь, экзосомы и т.д.) используются специальные наборы реагентов для извлечения высококачественной общей РНК или ДНК для обнаружения концентрации и чистоты (OD260 / 280) и оценки полноты.

• Ретротранскрипция (синтез cDNA):Использование Oligo (dT) или случайных экстрактов для мРНК; Для миРНК используются экстракты стеблевых колец или аддитивный метод, обеспечивающий одинаковую эффективность обратной транскрипции.

Третий этап: проверка на борту

• Построение системы:Настройка высококачественной системы реакции QPCR, установка не менее 3 технических повторов (Triplicates), устранение ошибки сложения.

• Запуск программы:Сбор флуоресцентных сигналов в реальном времени для создания кривой усиления.

Этап 4: Анализ данных

• Относительно количественные:использовать2-ΔΔКТРасчет различий в экспрессии генов в лабораторной группе по сравнению с контрольной группой.

  
  

• Количественная:Построить стандартный продукт плазмиды, нарисовать стандартную кривую и вычислить точное количество копий гена назначения в образце.

  
  

4. Наши основные преимущества

1. Аппаратная платформа:Основной количественный PCR, разница между отверстиями минимальна, стабильность данных высока.

2. Строгая система контроля качества:В соответствии с международным MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments） Руководящие принципы. Строгий мониторинг эффективности амплификации (90% - 110%) и линейных отношений (R² > 0,99) для устранения ложноположительных / ложноотрицательных.

3. Сложная обработка образцов:Обладает богатым опытом обработки образцов FFPE, микротканей, экзосом и цельной кровью, эффективно удаляет ингибиторы PCR.

4. Профессиональная доставка данных:Предоставляет не только исходные значения Ct, но и диаграммы усиления, диаграммы плавления, цилиндрические / тепловые диаграммы относительной экспрессии, а также полный отчет, содержащий подробные экспериментальные материалы и методы, которые непосредственно отвечают требованиям публикации SCI.

5. Сценарий применения

• Анализ уровня экспрессии генов:Проверка дифференциальной экспрессии мРНК, lncRNA, circRNA при различных условиях обработки или моделях заболевания (проверка qPCR после RNA - seq).

• Обнаружение miRNA:Исследования по регулированию экспрессии микроРНК.

• Варианты числа копий ДНК (CNV):Обнаружение амплификации или отсутствия опухолевых генов, определение количества копий ГМО.

• Подтверждение типа SNP:Идентификация генотипов мононуклеотидных полиморфных участков.

• Анализ патогенных микроорганизмов:Определение вирусной нагрузки, количественный анализ качества бактерий.

• ChIP-qPCR:Проверка обогащения фрагментов ДНК после иммунного осаждения хроматина для изучения взаимодействия белка - DNA.

6. Требования к отправке образцов и критерии доставки

• Направление образцов предложений:

• Клетки: Клеточное осаждение »

• 1 * 10 ^ 6， ПБС быстро замерзает после очистки.

• Организация:Животные > 50 мг, растительная ткань > 100 мг, жидкое азотное замораживание или сохранение RNAlater

• Кровь:Вся кровь нуждается в антикоагуляционной обработке или непосредственном предоставлении выделенной сыворотки / плазмы.

• РНК/ДНК:Концентрация > 50 нг / мкл, общий объем > 1 мкг, перевозка сухого льда.

• Содержание доставки:Полный отчет об эксперименте (включая этапы эксперимента, информацию о реагенте), файл исходных данных (.eds /.xls), график результатов анализа данных (статистические таблицы Excel и изображения высокой четкости).