TRZOL LS (Реактор для извлечения РНК из жидких образцов)

Свойства товара:

Условия хранения:

TRZOL LS стабильно сохраняется при комнатной температуре в течение 12 месяцев. Тем не менее, для достижения оптимального эффекта мы рекомендуем хранить в среде 2–8 °C.

Важное примечание:

Токсическое воздействие на кожу или неосторожное проглатывание может привести к ожогам. Сразу же после контакта с кожей его промывают большим количеством моющих средств и чистой воды. Если вы чувствуете недомогание, обратитесь к врачу и ищите правильное лечение с другими компонентами.

Презентация продукции:

Реактор TRZOL LS - это реагент, который извлекает общую РНК непосредственно из клетки или ткани. Он сохраняет целостность РНК при дроблении и растворении клеток. После добавления хлороформа в центрифугу образцы были разделены на слои проб воды, промежуточные слои и органические слои. РНК присутствует в водном слое. После сбора проб воды выше РНК может быть переработана путем осаждения изопропилового спирта. Независимо от того, являются ли они людьми, животными, растениями или бактериями, этот метод лучше отделяет небольшое количество и большое количество тканей и клеток. Простота работы реактивов TRZOL LS позволяет

Обработка нескольких образцов. Все операции могут быть выполнены в течение часа. Общая РНК, экстрагированная TRZOL, предотвращает загрязнение ДНК и белков и может быть использована для анализа отпечатков РНК, скрещивания пятен, скрининга poly (A) +, экстракорпорального перевода, анализа защиты РНК - ферментов и молекулярного клонирования. В случае использования для PCR, когда два экстракта находятся внутри одного экзона, рекомендуется обрабатывать экстрагированную общую РНК с помощью DNase I расширенного уровня.

Внимание:

Выделение образцов РНК из небольшого количества тканей (1 - 10 мг) или клеток (10 2 - 10 4 шт.): Добавление 800 мкл Трзола в ткань или клетку. После крекинга образца в него добавляют хлороформ и проводят экстракцию на этапе 2. До осаждения РНК изопропиловым спиртом в качестве носителя проб воды добавляется от 5 до 10 мкг гликогена без РНК - ферментов. Чтобы уменьшить его вязкость перед добавлением хлороформа его дважды отсасывали через шприц № 26 чтобы отрезать геномную ДНК. Гликоген остается в водном слое и выделяется вместе с РНК. Он не подавляет синтез первой цепи реакции обратной транскрипции до концентрации до 4 мг / мл.

2. После равномерного растворения и до добавления хлороформа образец может храниться при температуре 60°C или 70°C не менее одного месяца. Этанол, который осаждает РНК и растворяет 75%, может храниться не менее одной недели при 2–8 °C и не менее одного года при 5–20 °C.

При экстракции РНК с помощью TRZOL LS необходимо надевать перчатки и повязку для глаз. Избегайте контакта с кожей и одеждой. Завершение операции в химическом вентиляционном шкафу. Избегайте вдыхания дыхательных путей. Если нет исключений, комнатная температура поддерживается при 15–30 °C.

Собственные реактивы:

Хлороформ, изопропиловый спирт, 75% этанол (Rnase - Free Water), Rnase - Free Water (добавляют воду в стеклянные бутылки без РНК - ферментов, добавляют DEPC до 0,1% (V / V)). Поместить на ночь и стерилизовать под высоким давлением). 0,5% раствор SDS (Rnase - Free Water) (необязательно).

Шаги действия:

1. Предварительная обработка проб a. Биологическая жидкость добавляет 0,75 мл TRZOL LS на 0,25 мл жидкого образца (сыворотка, плазма и т.д.) и несколько раз продувает образец жидкости с помощью пушечного пистолета, чтобы помочь расщепить клетки в образце. Каждые 6 клеток от 5 до 10 × 10 добавляют не менее 0,75 мл TRZOL LS. Для образцов с высоким содержанием загрязнителей, таких как цельные образцы крови, их можно начать извлекать после того, как стерилизованная вода удваивается в пропорции 1: 1. Конечное отношение объема TRZOL LS к образцам жидкости всегда 3: 1. b. ткани перемешивают образцы тканей с помощью Glass или мощного симулятора, добавляя 0,75 мл TRZOL LS на 50 - 100 мг ткани или 0,25 мл тканевой суспензии. Как правило, объем ткани 50 ~ 100 мг должен быть меньше 0,25 мл, если объем образца ткани меньше 0,25 мл, добавьте стерилизованную воду, чтобы отрегулировать объем образца ткани до 0,25 мл, чтобы гарантировать, что отношение объема составляет 3: 1. c. Однослойные клетки добавляют растворенные клетки TRZOL LS объемом 0,3 мл - 0,4 мл непосредственно в культурную пластину диаметром 3,5 см, которая дуется с помощью аддитивных пушек, чтобы помочь полностью расщепить клетки. Требуемое количество TRZOL LS (0,3 - 0,4 мл на 10 см2) определяется площадью питательной пластины, а не количеством клеток. Нет необходимости добавлять воду в крекинг, потому что остаточный питательный раствор, прикрепленный к доске, полностью разбавляет TRZOL LS. D. Растущие в суспензии клетки осаждаются центрифугой. В реактиве TRZOL LS клетки многократно продуваются с помощью пипеток. На 5 - 10 × 10 6 клеток животных, растений или дрожжевых клеток или 0,75 мл TRZOL LS на 1 × 10 7 бактерий. Как и на этапе b, объем образца регулируется стерилизованной водой до 0,25 мл. Перед добавлением TRZOL LS следует избегать промывки клеток, так как это увеличивает вероятность распада мРНК. Разрыв некоторых дрожжей и бактерий может потребовать использования симулятора. 2. На этапе разделения гомогенный образец вылупляется на 5 мин при температуре 15 - 30 °C для разложения нуклеотидов. Добавьте 0,2 мл хлороформа на 0,75 мл TRZOL LS. Закройте крышку трубки образца, встряхните пробирку рукой в течение 15 секунд и вылупите ее при комнатной температуре в течение 2 - 15 минут. Замораживание центрифуги на высокой скорости 15 мин с центробежной силой не более 12 000 × г при 2 ~ 8 ° C. Постцентробежная смесь делится на три слоя: нижний слой - хлороформ, средний слой, верхний бесцветный слой проб воды. РНК присутствует в пробах воды без исключения. Вместимость водного слоя составляет около 70% от добавленной мощности TRZOL LS.

2. Осадок RNA переносит пробный слой в чистую пробирку, и органический и промежуточный слои также сохраняются, если они хотят отделить ДНК от белка. РНК осаждается путем смешивания проб воды с изопропиловым спиртом. Каждый 0,75 мл TRZOL LS соответствует 0,5 мл изопропилового спирта. Смешанные образцы вылупляются на 10 мин при температуре 15 - 30 °C и замораживаются на 10 мин с высокой скоростью центрифуги не более 12 000 × г при температуре 2 - 8 °C. Осадки РНК обычно не видны до центрифугирования, и после центрифугирования образуется коллоидное осаждение, прикрепленное к стенке и дну пробирки.

3. Дрейф РНК удаляет верхнюю суспензию. Промыть осаждение РНК с помощью 75% этанола (Rnase - Free Water) один раз и добавить не менее 75% этанола на 0,75 мл TRZOL LS. Вихревые колебания смешивают образцы и замораживают центрифуги на 5 мин с высокой скоростью центробежной силы не более 7500 × г при 2°C.

Рерастворение РНК при комнатной температуре простое высыхание РНК, а не центробежная сушка РНК в вакуумной трубке. Особенно важно, чтобы РНК не высыхала, что значительно снижает ее растворимость. Частично растворенные образцы РНК имеют соотношение OD260 / OD280 < 1,6. Для растворения РНК (если РНК позже будет использоваться для ферментативной реакции, избегайте использования СДС) путем переноса воды Rnase - Free или 0,5% раствора SDS (приготовленного из Rnase - Free Water) в несколько раз. РНК также может быть повторно растворена 100% аламидом (ионизирующим) и сохранена при - 70°C.

Основные шаги PCR и меры предосторожности.

I. Принцип эксперимента

PCR - это метод искусственного селективного расширения ДНК in vitro, который аналогичен репликации ДНК в организме. Для репликации ДНК в организме необходимы шаблоны, экстракты, ДНК - полимеразы, ДНК - деконуклеаза, dNTP; Реакция PCR in vitro также требует аналогичных компонентов, таких как шаблоны, экстракты, PCR Buffer, Taq - ферменты, dNTPs。 Среди них экстракт представляет собой искусственно сконструированную конкретную последовательность для достижения расширения в определенном месте; PCR Buffer обеспечивает буферную среду для реакции; Процесс реакции, как и внутри организма, открывается двойная цепь ДНК, и экстракт связывается с шаблоном, расширяясь, чтобы сформировать новую цепь. В то время как эти процессы происходят внутри организма с помощью ДНК - деконуклеазы, они достигаются вне организма путем контроля температуры реакции. Если обычно используется модифицированный шаблон ДНК 94°C, чтобы открыть двойную цепь, экстракт при температуре отжига соединяется с шаблоном и, наконец, завершает расширение при 72°C и повторяет этот процесс, чтобы достичь значительного расширения конкретного фрагмента ДНК. Только в начале третьего цикла образуются те же молекулы ДНК, что и в целевом сегменте ДНК, что и в дальнейшем циклически удваивает индекс целевого сегмента ДНК.

На более поздних стадиях расширения, из - за накопления продукта, первоначальная экспоненциально расширенная реакция становится плоской кривой, продукт больше не увеличивается с количеством циклов, что называется эффектом платформы. Период Платформы (Plateau) может привести к дальнейшему значительному увеличению до более высоких уровней низких концентраций неспецифических продуктов, которые ранее возникали в результате неправильного распределения. Поэтому следует соответствующим образом регулировать количество циклов, завершать реакцию до периода платформы и сокращать неспецифические продукты. Количество циклов, необходимых для достижения фазы платформы (Plateau), зависит от копии шаблона в образце.

II. Основные компоненты

Шаблоны могут быть в нескольких формах, в основном включают геномную ДНК, плазмидную ДНК, геномную ДНК, несущую вирус, продукты PCR, cDNA и т. Д. Но не могут быть РНК. Для различных типов шаблонов основное различие заключается в времени предварительной дегенерации и количестве шаблонов. Как правило, для больших геномных ДНК времени предегенерации 10 минут достаточно, плазмида DNA2min, вирусная геномная ДНК предегенерация 2 мин, продукт PCR предегенерация 2 мин.

Обратите внимание, что cDNA представляет собой одноцепочечную ДНК, но все же может быть шаблоном для PCR, за исключением того, что в первом цикле только один экстракт связывается и синтезирует другую цепь. Начиная со второго раунда, оба экстракта соединяются со специальной точкой, обеспечивая тем самым соединение с обычным ПКР. В то же время РНК, которая является одной цепью, не может выполнять амплификацию PCR, потому что реакция PCR реализуется с помощью ДНК - полимеразы, которая может быть идентифицирована только специально.

2. Для количества шаблона масса ДНК с системой 25ul, как правило, составляет 50 100 нг. Для геномной ДНК из - за ее сложной структуры концентрация экстракции также часто выше, поэтому для предотвращения воздействия чрезмерной концентрации на ПКР требуется градиентное разбавление извлеченной ДНК. В противном случае чрезмерная концентрация может привести к неспецифическому усилению. Для плазмиды и продуктов PCR разбавление не требуется из - за их простой структуры и, как правило, низкой концентрации экстракции.

На что следует обратить внимание при проведении эксперимента PCR?

Нет значения CT

При отсутствии значений Ct в результатах проверки выявляются следующие проблемы:

1, количество циклов недостаточно (как правило, не более 45 циклов, не только фоновое значение увеличено, количественное не допускается);

Ошибка настройки программы PCR, неправильные шаги для обнаружения флуоресцентных сигналов. Общий метод SG использует метод сбора при удлинении 72°C, закон TaqMan обычно собирает сигналы в конце отжига или при удлинении, кроме того, выбран ли сбор флуоресценции;

3. Деградация экстракта или зонда. При помощи электрофореза PAGE можно определить, разлагается ли экстракт и зонд;

Объем шаблона может разлагаться или быть недостаточным (не более 500 нг, в соответствии с инструкцией по комплекту реагентов), образец неизвестной концентрации должен начинаться с максимальной концентрации в серии разбавленных образцов; Если происходит разложение шаблона, следует учитывать введение примесей в подготовку образца и повторное замораживание и таяние, рекомендуется, чтобы образец шаблона был небольшим запасом, чтобы избежать повторного замораживания и таяния;

Подходит ли зонд экстракта (в частности, экстракт пересекает эндосументы, чтобы обеспечить расширение геномной ДНК); На амплификацию может также влиять значение Тм в верхнем и нижнем течении, превышающее 4°С).

Запоздалое значение КТ

В относительной количественной величине значение Ct обычно контролируется между 1525 и лучше, если в абсолютной количественной величине значение Ct увеличивается для образцов с низким числом копий, но обычно не должно превышать 40 циклов, иначе количественная величина неточна.

Таким образом, определение того, является ли поздний рост значения Ct ненормальным, должно основываться на конкретной экспериментальной конструкции и цели.

1.Низкая эффективность расширения. Соотношение между экстрактами или между экстрактами и зондами не подходит и требует оптимизации; Конструкция экстракта или зонда является неразумной и требует перепроектирования;

2. Процедура PCR не подходит, переход на трехэтапный метод для реакции или оптимизация температуры отжига / удлинения может быть надлежащим образом снижена температура отжига; Длительность отжига / удлинения короткая (может быть увеличена на 10 с в рекомендуемых временных условиях);

Концентрация MgCl2 не подходит, повышает концентрацию ионов магния и т.д. PCR разложение различных реакционных компонентов или недостаточное количество проб;

Продукты PCR слишком длинные. Продукты PCR рассчитаны более чем на 500bp;

5.В шаблонах присутствуют ингибиторы. Тестирование методом PCR с использованием шаблонов высокой чистоты или разбавление шаблонов.

Продукция, которую компания продает: