I. ПЕРЕДАЧА ПРОБЛЕМ: Избежание загрязнения и потерь

При передаче образцов из пробоотборника в обрабатывающий контейнер (например, чашку Петри, центробежную трубку) необходимо одновременно предотвращать загрязнение окружающей среды и потерю целевых микроорганизмов:

Операции в стерильной среде:

Передача должна осуществляться в шкафу биобезопасности с 75 - процентной дезинфекцией проб пробоотборника, поверхности контейнера и рук оператора перед операцией; Используйте стерильные соломинки, пипетки (головка пистолета должна быть стерилизована), чтобы избежать контакта с асептическими областями (например, наружная стенка контейнера).

Миф подсказывает: если вы работаете в открытой среде, разновидности бактерий в воздухе смешиваются с образцами, что приводит к ложно высокому количеству колоний, особенно на образцах с низкой концентрацией.

Полное удаление жидкости для отбора проб:

Для пробоотборников ударного и ситового типа после отбора проб необходимо многократно промывать головку отбора проб стерильным раствором (например, 0,85% асептического физиологического раствора, фосфатного буфера PBS) (не менее 3 раз), чтобы убедиться, что прикрепленные микроорганизмы полностью входят в раствор; Вихревые колебания в течение 1 - 2 минут (скорость вращения 2000 - 3000 rpm) разрушают скопления микробов и увеличивают дисперсию.

II. Разбавление выборки: обеспечение точности кратности разбавления

Когда концентрация микроорганизмов в образце выше, градиентное разбавление необходимо для получения числимого количества колоний (30 - 300 CFU / чашка Петри), и погрешность процесса разбавления напрямую влияет на точность результатов:

Разбавленная жидкость и контейнер: использование стерилизованных градиентных труб для разбавления (например, пробирки со спиральной крышкой емкостью 10 мл), предварительно оборудованных 9 мл стерильного разбавленного раствора (погрешность составляет ±0,1 мл); Отметить чёткое разжижение кратное (10⁻1, 10⁻² и т.д.), чтобы избежать путаницы.

Оперативные спецификации:

При переносе жидкости убедитесь, что кончик всасывающей трубы / головки пистолета контактирует с уровнем жидкости от 1 до 2 см, чтобы избежать вдыхания пузырьков;

При разбавлении от высокой концентрации к низкой концентрации каждый шаг должен быть смешан (протирание пробирки вручную 10 - 15 раз), чтобы обеспечить равномерное разбавление;

То же разбавленное кратное делает 2 - 3 параллельных образца, уменьшая случайные ошибки.

III. Культивирование и подсчет: контроль условий культивирования, стандартизация стандартов подсчета

Рост микроорганизмов сильно зависит от условий культивирования и требует строгого согласования параметров:

Выбор и подготовка среды:

В соответствии с целевым типом микроорганизмов выберите питательную среду (например, обнаружение бактериального питательного агара, грибка с картофельно - глюкозовым агаром PDA), питательная среда должна быть тщательно стерилизована (121°C пастеризация пара высокого давления в течение 20 минут), а pH соответствует требованиям (бактерия pH7.2 ~ 7.4, грибок pH5.6 ~ 5.8), чтобы избежать роста микроорганизмов из - за дефицита питательных веществ или кислотно - щелочного дискомфорта.

Контроль условий культивирования:

Температура: бактерия 36 ± 1 ° C, грибок 28 ± 1 ° C, инкубатор с постоянной температурой требует ежедневной калибровки температуры (ошибка ± 0,5 ° C);

Время: Бактерии культивируются 48 ± 2 часа, грибки культивируются 72 ± 2 часа, избегая слишком короткой культуры, которая приводит к утечке колоний или слишком длинной, чтобы привести к перекрытию колоний.

Правила подсчета:

Выберите количество колоний от 30 до 300 CFU для подсчета пластин (менее 30 результатов с большой погрешностью и более 300 колоний, которые легко перекрываются);

Если разница в количестве параллельных пластинчатых колоний с одной и той же степенью разбавления превышает 1 раз (например, 10 ⁻³ разбавленных пластин с 20 и 50), требуется повторное тестирование;

При подсчете необходимо различать целевые микроорганизмы и загрязняющие бактерии (определение может быть подкреплено морфологией колонии, хроматоскопией).

IV. Контроль качества: полная проверка надежности

Пустой контрольный эксперимент:

При обработке каждой партии проб устанавливается пустота отбора проб (пробоотборник не собирает воздух, культивируется только после промывки головки отбора проб смывной жидкостью) и эксплуатационный пробел (культивируется непосредственно стерильным раствором), если количество пустых колоний > 5CFU указывает на наличие загрязнения, необходимо провести повторный эксперимент.

Положительный контраст и проверка коэффициента возврата:

Регулярно имитируйте отбор проб с известными концентрациями стандартной бактериальной жидкости (например, кишечной палочки, золотистого стафилококка), рассчитывая коэффициент восстановления (коэффициент восстановления должен составлять от 70% до 130%, в противном случае необходимо проверить эффективность пробоотборника или процесс обработки).

Калибровка прибора:

Пробоотборник должен регулярно откалибровать расход (погрешность ±5%), чтобы избежать отклонения объема выборки из - за отсутствия расхода;

Миграционные пушки, инкубаторы и другое оборудование должны быть измерены и сертифицированы каждый год, чтобы обеспечить точные параметры.