“

　　Быстрая оптимизация условий синтеза PNA с помощью многофункционального многоканального PurePep Chorus

Пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) являются аналогами ДНК с полипептидным скелетом и имеют множество физико - химических свойств. Основной цепной каркас PNA состоит из N (2 - аминоэтил) - глициновой кислоты, соединенной с нуклеотидными основаниями через метилкарбонил.

Рисунок 1: Схема структуры пептидных нуклеиновых кислот и их связи с ДНК

Неионные аналоги пептидных нуклеиновых кислот, поскольку PNA не имеет отрицательного заряда и не имеет электростатического отталкивания между ДНК и РНК, стабильность и специфичность соединения значительно улучшаются, а способность к скрещиванию с молекулами ДНК или РНК намного лучше, чем у DNA / DNA / RNA / RNA, что проявляется в высокой стабильности скрещивания, отличной способности распознавать специфические последовательности и не гидролизуется нуклеазами и протеазами.

PNAs может подавлять экспрессию генов, связывая дополнения через RNAs. При определенных условиях экспрессия генов также может быть улучшена путем сочетания механизмов цепного вторжения с двухцепочечными последовательностями ДНК. Основываясь на этих преимуществах, PNA широко используется во многих областях в течение последнего десятилетия, а высокая сродство и специфичность делают их не только терапевтическими агентами, но и мощными инструментами для диагностики.

По мере углубления фундаментальных исследований PNA и появления новых технологий PNA будет демонстрировать лучшую производительность и более широкие перспективы применения.

　　Нынешние проблемы

Поскольку синтез подвержен полимеризации во время синтеза и имеет много побочных реакций во время обеззараживания, синтез PNAs сопряжен с большими проблемами. В ответ на проблему легкости полимеризации обычная стратегия заключается в использовании избыточного количества реагентов в реакции конденсации. Тем не менее, мономерные реактивы PNA для синтетической защиты на N - конце относительно высоки, и этот метод не получил широкого применения. Поэтому для успешной коммерциализации PNAs необходимо разработать относительно экономичный процесс синтеза.

　　Оптимизация условий синтеза на PurePep Chorus

В этой статье мы покажем быструю оптимизацию условий синтеза PNA на автоматическом синтезаторе PurePep Chorus.

PNA 1 будет использоваться в эталонных последовательностях для изучения различных синтетических параметров, таких как коэффициент избыточности, время реакции и температура мономера PNA. Условия синтеза PNA 1 с наивысшей чистотой будут использованы для синтеза остальных пяти последовательностей различной длины и содержания пуринов (аденин и гуанин) (см. таблицу 1). Чистота является ключевым фактором при изучении синтеза, поскольку пространственное сопротивление мономера PNA может легко привести к неполной реакции конденсации, что приводит к низкой чистоте.

Таблица 1: Информация о последовательности PNA в данном случае

PNA 1 синтезируется с помощью полипептидного синтезатора PurePep Chorus с синтетическим эквивалентом 25 мкмоль, используя смолу Rink Amide MBHA с коэффициентом замещения 0,27 ммоль / г и следуя ортогональной защите Fmoc / tBu. Для снятия защиты группы Fmoc на смоле используется 20 - процентный раствор DMF пиперидина, который реагирует при комнатной температуре 5 минут × 2 раза; Реакция конденсации основана на системах HCTU и NMM, подробные сведения о реакции приведены в таблице 2. После реакции конденсации выполняется операция уплотнения, при которой используется 10% раствор DMF ангидрида уксусной кислоты, который реагирует при комнатной температуре в течение 5 минут. После окончания последнего этапа снятия защиты смолу помещают в режущий раствор (TFA: TIS: H2O = 95: 2.5: 2.5) и реагируют при комнатной температуре в течение 4 часов.

Вышеуказанные действия позволяют настроить различные протоколы на программном обеспечении в соответствии с требуемыми условиями на Chorus, программное обеспечение автоматически вычисляет требуемое количество реагентов, прибор работает автоматически, увеличивая экономию на ручной работе и обеспечивая строгое выполнение программы испытаний.

Таблица 2

Анализ данных, приведенных в таблице 2, показывает, что при 10 - кратном реактивном эквиваленте PNA чистота продукта достигает 81%; Однако, основываясь на высоких ценах на синтетическое сырье Fmoc - PNA мономера, вышеупомянутая конструкция не может быть легко принята. Коэффициент реактивного эквивалента PNA был снижен в четыре раза, а чистота необработанного продукта - до 72%. В это время поддерживается коэффициент реактивного эквивалента PNA в 4 раза, температура реакции поднимается до 45°C и время конденсации уменьшается до 5 минут, а чистота продукта еще больше снижается до 61%. Из этого следует, что 5 - минутное время реакции слишком короткое для реакции конденсации. В это время другие условия остаются неизменными, увеличивая время реакции до 10 минут в отдельности (эксперимент D), а чистота грубых пептидов достигла 82%, что близко к результатам эксперимента A. Эксперимент Е использовался для дальнейшего изучения условий реакции, коэффициент реактивного эквивалента был скорректирован до 2, и было проведено 2 аддитивных реакции. Использовалось одинаковое количество реактивного сырья, и при одинаковом времени конденсации чистота продукта была увеличена на 5%.

Мы определили условия синтеза на основе максимального значения чистоты продукта PNA 1, и оставшиеся последовательности будут синтезированы таким же образом, как и PNA 1 (метод E). Результаты показаны в таблице 3:

Таблица 3: Использование метода E для синтеза необработанных результатов по остальным пяти PNA

Чистота необработанного продукта пяти синтетических PNA, описанных выше, составляет от 66 до 91%, что является удовлетворительным результатом для пептидных нуклеиновых кислот. Интересно, что продукты PNA с более высоким содержанием пурина имеют более высокую чистоту.

Рисунок 2: 5 хроматографий, собранных продуктами PNAs с помощью UPLC - UV - системы на длине волны 210нм. Система UPLC - это Waters H - class UPLC / ESI - MS, хроматографическая колонка C18 (1,7 мкм, 2,1 x 50 мм). Фаза потока составляет 0,1% TFA в воде (A) в смешанном растворе с ацетонитрилом (B).

　　резюме

В этой прикладной литературе мы подробно обсудили способы оптимизации синтеза PNA с помощью системы PurePep Chorus. Первоначально мы использовали 10 - кратный реактивный эквивалент PNA для конденсации реакций при комнатной температуре в течение 1 часа, что позволило получить необработанный продукт с чистотой 81%. Мы стремимся сократить использование реакторов и свести к минимуму их воздействие на чистоту необработанных продуктов, чтобы сделать реакцию более экономичной, устойчивой и отвечающей требованиям зеленой химии. В конце концов, мы разработали методы, которые уменьшают количество и чистоту реактивных веществ. Используя метод 2 - кратного конденсации, каждый образец с удвоенным реакционным эквивалентом реагирует в течение 5 минут при 45°C, что повышает чистоту PNA 1 с 81% до 87%. Этот метод был использован для синтеза пяти других PNA.

Для пептидных нуклеиновых кислот различной длины и содержания пуринов этот метод дает хорошие продукты. Полипептидный синтезатор PurePep Chorus является отличным инструментом для этой работы, поскольку синтетические схемы могут быть гибкими по мере необходимости; Например, изменить коэффициент эквивалентности реакции, количество повторений, температуру и время. В то же время автоматизированные инструменты и автоматизированные вычислительные функции программного обеспечения помогают уменьшить ручную работу и риск ошибок, а оптимизированные условия синтеза могут быть легко применены к другим синтезаторам PNAs.