4 апреля 2025 года, Калифорнийский институт Скриппса.Профессор Кендалл У. НеттлсиJohn R. Yates III опубликовал статью в журнале Nature Chemical Biology под названием « Native top - down proteomics enables discovery in endocrine - resistant breast cancer».В этой статье был разработанПолитика Native Top - Down Proteomics (NTDP)Протеоидные комплексы, используемые для идентификации клеток рака молочной железы (включая модель эндокринной резистентности к гиперэкспрессическим рецепторам эпидермальных факторов роста (EGFR)) с содержанием 70 кDa, были идентифицированы в общей сложности104 комплекса из 17 белковых комплексов(Конкретная форма сборки белковых комплексов). Исследование показало, что EGFR индуцирует диссоциацию сборки ядерного транспортного фактора 2 (NUTF2), в то время как трансформированные участки NUTF2 K4 и K55 оказывают дифференциальное влияние на подавление сигнального пути рецептора эстрогена (ER). Исследование раскрывает молекулярные характеристики белка рака молочной железы и роль сложных xoforms в росте опухолей и терапевтической устойчивости, предлагая новые перспективы для понимания механизмов заболевания и разработки лекарств.

(Нажмите для просмотра большой карты)

один

Предыстория исследования

Согласно последним данным Международного агентства по изучению рака ВОЗ, в 2020 году во всем мире было зарегистрировано 2,26 миллиона новых случаев рака молочной железы, что превышает 2,2 миллиона случаев рака легких. Рак молочной железы заменил рак легких и стал крупнейшим раком в мире. Белки собирают функциональные комплексы через нековалентные взаимодействия, приводящие к тому, что клетки включают в себя почти все ключевые функции, связанные со злокачественными опухолями, такими как рак молочной железы, в то время как различные Протеофоры белка, возникающие в результате дифференциального сдвига, последовательности, постинтерпретационной модификации (PTMs) или мутации, влияют на формирование, стабильность и активность этих функциональных комплексов. Традиционные методы протеомики « снизу вверх» имеют ограничения в определении протооформа, производимого отдельными белками, рецепторов и вспомогательных факторов, которые характеризуют соединение с белковыми комплексами, а также в построении комбинированных моделей PTMs. Native Top - down Proteomics (nTDP), образованная в сочетании с протомасс - спектрометрией (Native MS) и протеомикой сверху вниз (Top - down Proteomics), обладает способностью к структурному анализу, но из - за низкого содержания белковых комплексов в сложных биологических образцах, трудностей разделения белковых комплексов и отсутствия биоинформационных инструментов для обработки массивных наборов данных nTDP, nTDP в настоящее время в основном используется для анализа очищенных белковых комплексов и имеет меньше применений в сложных биологических образцах. В исследованиях рака молочной железы передача сигнала фактора роста является одним из основных механизмов сопротивления эндокринной терапии, а расширение рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и мутация сигнального компонента вниз по течению связаны с клиническим сопротивлением тамоксифену, но конкретный механизм еще не определен. Поэтому необходим эффективный подход к изучению характеристик белковых сборок в клетках рака молочной железы, чтобы глубоко понять молекулярные механизмы заболевания и разработать эффективные лекарства, которые обеспечивают фон и мотивацию для исследования по разработке и применению стратегии nTDP.

два

Методы исследования

1

Объекты исследования:

ЭР - рецептор α (ER - α) - положительная клетка рака молочной железы MCF - 7 (далее - клетки MCF - 7) и гиперэкспрессивный рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) - клетка MCF - 7 (в качестве модели резистентности для ER - таргетной терапии, далее - клетки MCF - 7 - EGFR).

2

Рабочий процесс NTDP

Рабочий процесс nTDP, разработанный исследователями, как показано на рисунке 1, сначала использует автономную нативу - резистивную хроматографию (nSEC) для извлечения растворимых белковых комплексов из клеток для разделения; Затем через nano - ESI - FAIMS - MSN (Жидкая фаза: Easy - nLC 1200, устройство разделения газовой фазы: FAIMS, масс - спектрометрия: Orbitrap Fusion LumosВыполнение описательного анализа белковых комплексов Native top - down; Окончательное использованиеПроSight NativeПрограммное обеспечение в сочетании с ручной коррекцией анализирует сложные масс - спектральные данные.

Рисунок 1: Рабочий процесс nTDP (щелкните, чтобы увидеть большую диаграмму)

три

Результаты исследований

1

Проверка рабочего процесса nTDP

Исследователи сначала использовали три белковых комплекса: carbonic anhydrase II(CA II，~29.1 kDa)，streptavidin (SA， ~53 kDa) ，avidin (AV，~67 kDa) Проверьте воспроизводимость и надежность системы nano - ESI - FAIMS - MSN. Результаты показали, что система может стабильно разделять и расщеплять белковые комплексы, генерируя масс - спектральные данные, которые могут эффективно прояснять белковые представления (рис. 2 - 4). Также было доказано, что FAIMS может отделять белковые комплексы до 70 кД на уровне газовой фазы. (Диаграмма 5)

Рисунок 2: Спектр NTDP CA II и его фрагменты, созданные ProSight Lite

Рисунок 3: Спектр NTDP SA и его фрагменты, созданные ProSight Lite

Рисунок 4: Спектр NTDP AV и его фрагменты, созданные ProSight Lite

Рисунок 5: Диаграмма миграции базовых пиков стандартных белковых комплексов и их значения CV

(Нажмите для просмотра большой карты)

Нажмите вниз, чтобы увидеть все

2

Анализ NTDP MCF - 7 и

MCF - 7 - Экстракт клеток EGFR

Затем исследователи использовали систему nSEC для разделения клеточных экстрактов клеток рака молочной железы (MCF - 7 и MCF - 7 - EGFR), и результаты спектра nSEC показали, что белковые комплексы, взятые из MCF - 7 и MCF - 7 - EGFR (16 повторяющихся экспериментов), стабильно и эффективно отделяются. Обнаружение отдельных белковых комплексов с помощью системы nano - ESI - FAIMS - MSN104 комплекса из 17 белковых комплексовВключает белково - металлические комплексы, белково - белково - металлические комплексы и белково - белковые комплексы.

Рисунок 6: Спектроскопия nSEC белковых маркеров и белковых кластеров в MCF - 7, белковых кластеров в клетках MCF - 7, белковых маркеров в MCF - 7 - EGFR и белковых кластеров в клетках MCF - 7 - EGFR. (Нажмите для просмотра большой карты)

3

Анализ белковых комплексов, связанных с раком молочной железы

• Комплексные формы ТПИ:TPI - это гликолаза, связанная с раком молочной железы, и исследования показывают, что TPI может быть связан с лекарственной устойчивостью, прогрессированием опухолей и метастазами. Исследователи наблюдали структуру димера TPI в клетках MCF - 7 и MCF - 7 - EGFR с молекулярной массой около 53 кД (nSEC - fraction4). Диомерный комплекс TPI образуется комбинацией усеченных и фосфатированных мономерных вариантов белка, на которых происходит два деамида (N15 и N71). Исследователи также обнаружили комплекс TPI, образованный мутантным (E104D) мономером TPI, и TPI мономеров E104D может быть фосфорилирован, деамидирован или ацетилирован.

Рисунок 7: Спектроскопия NTDP комплекса TPI complexoforms в клеточном экстракте MCF - 7

• Комплексные формы MIF:MIF - это многофункциональный цитокин, биологически значимый для многих видов рака, аутоиммунных заболеваний и воспаления, и исследователи обнаружили высокую экспрессию MIF как в клетках MCF - 7, так и в клетках MCF - 7 - EGFR, а спектрограмма native MS1 дает подробную информацию о MIF complexoforms, которые образуют в общей сложности пять MIF (гомогенных и гетерогенных) триомерных структур. Через MSнАнализ спектрограммы выявил усеченные, необработанные, нитрифицированные и ацетилированные варианты мономеров MIF (нитрификация и ацетилирование происходят на C80 и K77 соответственно).

Рисунок 8: Спектроскопия NTDP комплекса MIF complexoforms в клеточном экстракте MCF - 7

Комплексные формы SOD1:Металаза SOD1 является важным антиоксидантом для раковых генов, приводящих к образованию опухолей молочной железы и преобразованию супероксидов в O2& H2О2Крайне важно. Исследователи наблюдали структуру димера SOD1 с молекулярной массой около 32 кД в клетках MCF - 7 и MCF - 7 - EGFR и Cu в субъединице белкового варианта SOD1 из спектрограммы MS1 (состояние заряда 11 +) и MS2 (состояние заряда 6 +).2 +& Zn2 +Нековалентное связывание ионов металлов, варианты белка SOD1 также имеют N - концевое ацетилирование, пару дисульфидных связей (C57 - C111) и резекцию N - концентрата метионина.

Рисунок 9: NTDP - карта комплекса SOD1 complexoforms в клеточном экстракте MCF - 7

Комплексные формы NUTF2:NUTF2 - это димер - белок, который опосредует внутриядерный перенос небольшого фермента GTP Ran. Исследователи идентифицировали восемь различных комбинаций белков NUTF2 из клеток MCF - 7 и MCF - 7 - EGFR, которые были распределены между 26 различными комплексами. Из спектрограммы MS1 было обнаружено, что эндогенные димеры NUTF2 в MCF - 7 - EGFR значительно меньше, чем в клетках MCF - 7 - EGFR, и что изодимеры NUTF2 с тремя ацетилированиями характерны для клеток MCF - 7 - EGFR.

Рисунок 10: MCF - 7 и MCF - 7 - NTDP - карта NUTF2 в клеточном экстракте EGFR

Рисунок 11: MCF - 7 и MCF - 7 - Информация о прочности NUTF2 complexoforms и proteoforms в клеточном экстракте EGFR

Нажмите вниз, чтобы увидеть все

4

NUTF2 представляет взаимодействие между EGFR и ER - каналами

Предварительные данные NTDP показали, что количество димеров NUTF2 в клетках MCF - 7 - EGFR значительно ниже, чем в клетках MCF - 7, и исследователи использовали NUTF2 для осаждения с двумя различными аффинными метками.EGFR может вызвать диссоциацию димера фактора ядерного транзита 2 (NUTF2). Точки посттрансляционной модификации NUTF2 (PTM) являются консервативными у позвоночных, а кристаллическая структура белкового комплекса NUTF2 указывает на то, что K4 находится вблизи точки связывания ядерных пористых белков. K55 и K63 были близки к точке соединения Ran, где K55 участвовал в водном опосредованном контакте между Ran и NUTF2, поэтому исследователи мутировали точки K4 и K55. Результаты показали,Выражение NUTF2 в клетках MCF - 7 подавляет рост клеток рака молочной железы, мутация K4Q может обратить вспять ингибирование, а мутация K55R усиливает ингибированиеЭто показывает, что точки PTM (K4, K55) могут регулировать рост клеток, влияя на связывание ядерных отверстий или взаимодействие Ran. NUTF2 понизил ген размножения GREB1, индуцированный эстрогеном, а мутация K4Q восстановила фенотип без 4OHT. Это указывает на то, что NUTF2 proteoforms в разных точках PTM приводит к различным биологическим результатам.

Рисунок 12: NUTF2 регулирует передачу сигналов ER и подавляет рост

(Нажмите для просмотра большой карты)

Для дальнейшего изучения того, как NUTF2 регулирует передачу сигналов ER и реакцию на 4OHT, технический анализ CUT & RUN показал, что точки связывания ER и NUTF2 в клетках MCF - 7 в основном не перекрываются, но экспрессия NUTF2 и обработка 4OHT изменяют режим связывания ER. Выражение NUTF2 может привести к различиям в сочетании ER на 1353 сайтах, а также к 4OHT - обработке MCF - 7 и MCF - 7НУТФ2Позиции ER - соединения клеток перекрываются и различаются. Однако на чувствительных к 4OHT участках NUTF2 было обнаружено всего 132 общих полубита ER - последовательности (« 1 - AGGTCA»), что указывает на то, что NUTF2 регулирует долю и активность ER - хроматина с помощью косвенных механизмов. Чтобы получить более четкое представление о молекулярном механизме ингибирования роста NUTF2, исследователи завершили RNA - seq клеток MCF - 7 и MCF - 7NUTF2, где анализ концентрации генов показал, что в более чем 600 различных экспрессивных генах, в том числе в генах, связанных с повышением метаболической корреляции РНК - разложения, ингредиентах комплекса NURD (таких как HDAC1) и апоптотическом гене ERRFI1, генах, связанных с подкислением митохондрий оксидом фосфора (таких как BCL2) и генах, вызывающих рак (таких как семейство RA Анализ концентрации каналов показывает, что эти гены включают в себя различные пути, связанные с раком и EGFR, и поддерживают роль NUTF2 как сигнального фактора EGFR. Исследования соседних белков ER - α - APEX2 показали, что экспрессия NUTF2 изменяет группы взаимодействия ER, включая увеличение маркеров JunB, снижение маркеров HSPBP1 и CSDE1. Сравнение NUTF2: WT с клетками NUTF2: K4Q выявило различия в группах взаимодействия ER (например, увеличение маркеров CNOT9 и уменьшение маркеров DNMT3A), что еще раз подтверждает, что NUTF2 влияет на пути, регулируя взаимодействие белков, связанных с ER.

Рисунок 13 Взаимодействие NUTF2 - ER

(Нажмите для просмотра большой карты)

четыре

Выводы и значение

1

Успешное создание и применение методологии NTDP

Исследование оптимизировало nTDP workflow, в сочетании с оффлайновой проторазмерной хроматографией (nSEC), ионизацией нано - электрическим распылением (nano - ESI), спектром полевой асимметричной миграции ионов (FAIMS) и многоступенчатой последовательной масс - спектрометрией (MSN), успешно идентифицировало 104 комплекса белков из 17 типов раковых клеток молочной железы (MCF - 7 и MCF - 7 - EGFR), включая белково - металлические комплексы, белково - металлические комплексы, белково - белково - белковые комплексы и т. Д., которые характеризуют сборку эндогенных белков в размере 70 кД, преодолевая традиционные методы анализа образцов с низким уровнем биоразнообразия. Ограничения изобилия белковых комплексов.

2

Обнаружение и функциональный анализ ключевых белковых комплексов

Были идентифицированы ключевые белковые комплексы, связанные с раком, такие как изомераза фосфата - пропанола (TPI), ингибиторы миграции макрофагов (MIF), супероксид - диффузы (SOD1) complexoforms, и были уточнены их точки постпереводной модификации (PTMs) (например, деамидирование TPI, фосфатирование, нитрификация MIF, ацетилирование, связывание металлов SOD1 и т. Д.) и их влияние на структуру и функции комплекса. Обнаружение ядра: гиперэкспрессия EGFR вызывает диссоциацию димера фактора ядерного транзита 2 (NUTF2). Димеры NUTF2 участвуют в ядерном вводе RAN в качестве челночного белка с ядерными отверстиями, и их гиперэкспрессия может подавлять рост клеток рака молочной железы, в то время как мутации в различных местах PTM (K4 и K55) могут обратить вспять или усилить этот ингибирующий эффект, предполагая, что PTMs NUTF2 влияют на рост рака молочной железы, регулируя сигнальный путь рецептора эстрогена (ER).

3

Механизм связи NUTF2 с эндокринной резистентностью к раку молочной железы

NUTF2 воздействует на сигнальные пути ER, косвенно регулируя связи ДНК ER и сети белковых взаимодействий, такие как GREB1, ген размножения, индуцированный эстрогеном, и ERRFI1, который улучшает апоптоз, тем самым подавляя рост клеток рака молочной железы. Гиперэкспрессия EGFR (модель резистентности эндокринной терапии) снижает уровень димера NUTF2 и изменяет его режим PTMs, что приводит к аномальному регуляционному воздействию NUTF2 на ER - сигналы и может быть одним из важных механизмов сопротивления Тамоксифену, опосредованного EGFR.

4

Значение области NTDP

Этот метод предлагает новую парадигму для крупномасштабного анализа эндогенных белковых комплексов в сложных биологических образцах, которые сохраняют хрупкие нековалентные взаимодействия, точно характеризующие протооформ ПТМ, модели сборки и комбинации соединений, открывают новые возможности для биологии рака, обнаружения лекарственных мишеней и исследований структурной биологии, особенно для понимания молекулярных механизмов сопротивления лечению рака молочной железы.

Если вам нужно сотрудничество для воспроизведения этой статьи, пожалуйста, оставьте сообщение в конце текста.