Бифлуоресцентный энзим. Набор для генетического тестирования.

Firefly и Renilla Assay Kit (Бифлуоресцентный энзим. Набор для генетического тестирования.Эффективные средства для определения экспрессии генов, активность флуоресцентной ферменты светлячка (Firefly luciferase) и фермента флуоресцента морской почки (Renilla luciferase) в DLR - тестах последовательно обнаруживается в отдельных образцах. Сначала люциферин (Luciferin) используется в качестве основы для обнаружения активности флуоресцентных ферментов светлячка, а затем добавляется вещество, которое ингибирует каталитический эффект флуоресцентных ферментов светлячка, в то время как Coelenterazine (Coelenterazine) обнаруживает активность флуоресцентных ферментов морской почки и реализует двойной флуоресцентный фермент, сообщающий о генетическом тестировании. Благодаря биолюминесцентной системе флуоресцентных ферментов и их субстратов экспрессия генов может быть очень чувствительной и эффективной. Обычно транскрипционные регуляторы интересующих генов или 5 'инициирующих подсекторов клонируются в верхнем течении Luciferase или в нижнем течении Luciperase клонируются в 3' - UTR - области, чтобы построить плазмиды подотчетного гена (Reporter gene), а затем транскрипционные клетки, обработанные соответствующими лекарствами и т. Д. Клеточные посткрекинговые клетки, определяют транскрипционное регулирование генов назначения, таких как фармакологическая обработка, путем определения уровня активности флуоресцентных ферментов. Гелиофлюминесцентные ферменты чаще используются в качестве внутреннего женьшеня для определения эффективности транскрипции, чтобы устранить различия в количестве клеток и эффективности транскрипции.
Флуоресцентная фермента светлячка - это белок молекулярной массой около 61 кД, который в присутствии АТФ, ионов магния и кислорода катализирует флуоресцентную генерацию оксида флуоресцента (Oxyluciferin), который генерирует световые сигналы во время окисления флуоресцента. Гетерофлуоресцентная фермента - это белок молекулярной массой около 36 кД, который в присутствии кислорода может катализировать окисление энтероциклина в кишечный амид (Coelenteramide), а также генерировать световые сигналы во время окисления энтероциклина. Световые сигналы в этом наборе могут быть измерены с помощью химического люминесцентного прибора, энзимометра или флюорометра. Набор реагентов имеет характеристики быстрого обнаружения, высокой чувствительности, широкого диапазона обнаружения и отсутствия внутриклеточных помех активности.
Характеристики продукта:
Быстрый: клеточный крекинг завершается за 10 - 15 минут.
Удобно: реагенты легко изготавливаются, шаги обнаружения образцов просты.
Чувствительность: можно обнаружить Zui ниже 10-20Мол, флуоресцентные ферменты.
Линейный диапазон концентрации ферментов может достигать 8 порядков.
Компоненты продукции:

1 Клеточный крекинг
(1) Удалите питательную среду и аккуратно промывайте PBS два раза (клетки, прикрепленные к стенке, могут выполнять эту операцию напрямую, а взвешенные клетки требуют центробежного сбора клеток). Добавьте 1 × Lysis Buffer (разбавляйте компонент А 4: 1 стерильной водой) и поместите питательную пластину на микрогенератор при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы полностью расщепить клетку.
Примечание: Продукты крекинга могут храниться при комнатной температуре 6 ч и при температуре - 70 °С могут храниться длительное время (продукты крекинга не могут быть повторно заморожены и расплавлены).
(2) Продукт крекинга 10 000 - 15 000 rpm центрифуга 3 - 5 мин, после центрифугирования верхняя жидкость переносится в новую трубку EP для последующего обнаружения.
Примечание: Клетки могут быть обнаружены сразу после крекинга или заморожены, а затем обнаружены, когда это необходимо. Замороженные образцы должны быть расплавлены до комнатной температуры, а затем проверены.
2. Приготовление рабочей жидкости
(1) Восстановление всех компонентов до комнатной температуры.
(2) Компонент C полностью растворяется в компоненте B и образует рабочую жидкость флуоресцентной ферментации светлячка 0,2 мг / мл.
Примечание: Рабочий раствор флуоресцентных ферментов светлячка не может быть повторно заморожен и расплавлен, если количество однократного эксперимента меньше, рекомендуется разделить на небольшие спецификации по количеству однократного использования.
(3) Компонент E разбавляется в рабочую жидкость флуоресцентной ферментации морской почки с использованием компонента D, при этом компонент 1 ul E добавляется к компоненту 49 мкл D.
Примечание: Рабочий раствор гидронефроллюминесцентных ферментов требует использования в настоящее время.
3 Химическая люминесценция
(1) Включите прибор, который имеет функцию обнаружения химической люминесценции в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора, такой как многофункциональный энзимометр, установите параметры, время измерения 10 s, интервал измерения 2 s.
(2) При измерении каждого образца взять образец 20 - 100 ul (если количество образца достаточно, добавьте 100 ul; если количество образца недостаточно, количество использования может быть соответствующим образом уменьшено, но количество испытательного отверстия должно быть последовательным). 1xLysis Buffer - Пустой контраст.
(3) Добавьте 100 ul флуоресцентный детектор фермента светлячка для определения значения RLU (relative light unit) (рекомендуется, чтобы энзимометр установил функцию смешивания Shaking).
Примечание: Поскольку это свечение является мгновенным, рекомендуется сразу же после добавления рабочей жидкости флуоресцентной ферменты светлячка провести тестирование.
(4) Добавьте 100 уль морской нефроллюциновой рабочей жидкости для определения значения RLU (relative light unit) (рекомендуется, чтобы энзимометр установил функцию смешивания Shaking).
(5) Значение RLU, измеренное с помощью флуоресцентной ферментации светлячка, делится на значение RLU, измеренное с помощью флуоресцентной ферментации морской почки. Степень активации генов, сообщаемых в различных пробах, сопоставляется по полученным значениям. Аналогичные расчеты могут быть произведены, если в качестве эндогена используется флуоресцентный фермент светлячка.

- 20°C Сохранить. Компонент C рекомендует предварительно использовать асептическую воду, настроенную на 2 мг / мл резервуара, компоненты B, D и C, настроенную на резервуар,
Сборка небольших партий в соответствии с экспериментальными потребностями. Все тестовые рабочие жидкости рекомендуется использовать в настоящее время, чтобы избежать повторного замораживания и таяния.

Флуоресцентные ферменты сообщают о наборах для генетического тестирования,Бифлуоресцентный энзим. Набор для генетического тестирования.