Fluo - 8 AM Набор для обнаружения потока кальция в клетках без стирки

Fluo - 8 AM Набор для обнаружения потока кальция в клетках без стиркиКомпоненты и спецификации являются следующими. Рекомендуется использовать реактив Fluo - 8 для загрузки клеток 96 - диафрагмы 100 мкл на отверстие и 384 - диафрагмы 25 мкл на отверстие. 96T, 960T и 9600T могут выполнять эксперименты с 1, 10 и 100 96 - пористыми или 384 - пористыми пластинами соответственно.

В соответствии с экспериментальными потребностями клетки вводятся в прозрачные черные клеточные питательные пластины на дне 96 - или 384 - отверстия с концентрацией сыворотки в клеточной питательной среде не более 10%. Для эксперимента требуется 37°C 5% CO2В инкубаторе некоторое время.
2. Удалите Fluo - 8, чтобы загрузить буфер и реагент QF (10x), сбалансированный до комнатной температуры, полностью смешанный.
3, вынуть Fluo - 8 AM, растворить при комнатной температуре, центробежный сбор содержимого на дне трубы, поместить на лед. Если Fluo - 8 AM не является одноразовым исчерпанием, его следует распределить, чтобы избежать сохранения света при температуре 20°C, избегая повторного замораживания и оттаивания.
Расчет необходимого количества реагентов для наполнения клеток Fluo - 8 по объемам, таким как добавка в отверстие и питательная среда в отверстии
Составление клеточного наполнителя Fluo - 8: добавьте реагент 10x QF в 10 - кратное разбавление в буфер загрузки Fluo - 8, например, реагент 1mL 10x QF в буфер загрузки 9mL Fluo - 8, полностью смешанный. Fluo - 8 AM составляет 400X, добавляя вышеописанный буфер загрузки Fluo - 8 (содержащий 1x QF) в соответствии с 1X, который является реактивом для загрузки клеток Fluo - 8.
Некоторые клетки, такие как клетки CHO, нуждаются в добавлении C - сульфосу (Probenecid, CAS: 57 - 66 - 9) в реактив для загрузки клеток Fluo - 8, чтобы подавить клетки, которые будут транспортировать Fluo - 8 из клеток, которые попадают в клетку. С - сульфосу поставляется самим клиентом, рекомендуется добавить Fluo - 8 клеточный погрузочный реагент с конечной концентрацией 2,5 мМ. Для различных клеток оптимальную концентрацию, возможно, необходимо оптимизировать.
Изготовление C - сульфоната:Из 1N NaOH производится 500 мм сырой жидкости, которая перед использованием разбавляется до 250 мм буфером 1X HBSS и добавляется в клеточный погрузочный реагент Fluo - 8 с конечной концентрацией 2,5 мМ (буфер HBSS предоставляется самим клиентом по формуле 20 мм HEPES buffer pH7.4 + 1X Hank 's Balanced Salt Solution, pH 7.4).
Стандартный метод обнаружения: добавьте реагенты для клеточной загрузки Fluo - 8 такого объема, как питательная среда в отверстии клеточной питательной пластины, например, 100 мкл питательной среды на отверстие 96 - пористой пластины, добавьте 100 мкл Fluo - 8 для клеточной загрузки.
（Дополнительные методы обнаружения:Среда, содержащая 10% FBS, может снижать чтение и увеличивать фон, удаляя внутреннюю среду отверстия, смешивая реагенты для загрузки клеток Fluo - 8 (изготовленные на этапах 5 и 6) и буфер HBSS 1: 1, добавляя эту смесь, эквивалентную 2 - кратному объему первичной среды. Или культивирование клеток с использованием питательных сред с низкой концентрацией FBS, обнаруженных стандартным методом на этапе 7.)
Восемь, тридцать семь градусов инкубации в течение часа. Конкретная температура инкубации (например, комнатная температура или 37°C) и время (0.5hr - 2hr или более) должны быть оптимизированы в соответствии с конкретным экспериментом.
9. Проводить внутриклеточное обнаружение потока кальция: в соответствии с экспериментальными потребностями и оборудованием для обнаружения параметров обнаружения, добавить тестовое соединение, нижние показания для определения интенсивности флуоресценции. Применимые устройства обнаружения включают FlexStation, FLIPR (Molecular Devices) и другие. Для чтения флуоресценции FlexStation 3 используется Ex / EM = 485 / 525 нм.

Различные партии не рекомендуется смешивать.
2) Без проверки, не рекомендуется изменять количество тестового реагента.