Подготовка моноклональных антител

Моноклональные антитела (MAb) являются антителами, вырабатываемыми специализированными антигенными детерминантными кластерами, и технология моноклонирования, также известная как технология гибридных опухолей, возникла в 1975 году и была основана Г. Колером и Мильштейном. Основной принцип заключается в том, чтобы использовать B - клетки, которые вырабатывают антитела, скрещиваются с опухолевыми клетками и сливаются в гибридные опухолевые клетки для производства антител.

Основными этапами подготовки моноклонального сопротивления с помощью гибридных опухолей являются:

(1) Подготовка антигена,

(2) Иммунные животные,

(3) Подготовка иммунных селезеночных клеток и клеток миеломы,

(4) Клеточное слияние;

(5) селективная культура клеток гибридной опухоли,

(6) скрининг гибридных опухолевых клеток;

(7) клонирование клеток гибридной опухоли;

(8) Определение моноклональных антител;

(9) Создание клеточной линии гибридной опухоли, выделяющей моноклональные антитела:

(10) Массовая подготовка моноклональных антител.

Процесс подготовки моноклональных антител:

Иммунные животные - это процесс, при котором мыши получают чувствительные B - лимфоциты с помощью целевых антигенов для иммунизации мышей. Самки мышей Balb / c в возрасте 6 - 8 недель обычно выбираются для иммунизации в соответствии с заранее разработанной программой иммунизации. Антигены попадают в периферический иммунный орган через кровообращение или лимфатический цикл, стимулируя клонирование соответствующих B - лимфоцитов, активируя их, размножая и дифференцируя в сенсибилизирующие B - лимфоциты.

2. Клеточная интеграция с использованием метода удаления крови из глазного яблока для казни мышей, стерильная операция для удаления селезенки, экструзионное шлифование в плоской чашке Петри, подготовка селезеночной клеточной суспензии. Готовые гомологичные клетки миеломы смешиваются с клетками селезенки мыши в определенной пропорции и добавляются в качестве катализатора полиэтиленгликоля. Под полиэтанолом различные лимфоциты могут сливаться с клетками миеломы, образуя гибридные опухолевые клетки.

Целью селективной культуры является скрининг слитых гибридных опухолевых клеток, обычно с использованием селективной среды HAT. В питательных средах HAT неинтегрированные клетки миеломы умирают из - за отсутствия гиповопуриновой гуанинофосфатной трансферазы, которая не может синтезировать ДНК с помощью средств правовой защиты. Хотя неинтегрированные лимфоциты имеют гиповопуринин - гуанин - фосфат - трансферазу, они не могут выжить в течение длительного времени вне организма и постепенно умирают. Только слившиеся гибридные опухолевые клетки выживают и размножаются в HAT - питательных средах, поскольку они получают субфлавонин - гуанин - фосфат - трансферазу из селезеночных клеток и обладают свойствами неограниченного размножения клеток миеломы.

Отбор и клонирование положительных клонов гибридной опухоли гибридных опухолевых клеток, выращенных в питательных средах HAT, только несколько из них являются клетками, которые выделяют заранее специфические моноклональные антитела, поэтому они должны быть подвергнуты скринингу и клонированию. Клонирование гибридных опухолевых клеток обычно производится методом ограниченного разбавления. Отбор положительных гибридных опухолевых клеток, способных вырабатывать необходимые моноклональные антитела, с использованием чувствительных, быстрых и специфических иммунологических методов и клонирование для амплификации.

После полной идентификации типа иммуноглобулина, подкласса, специфичности, сродства, распознавания поверхностного положения антигена и его молекул, выделенных моноклональными антителами, своевременно замораживается.

5.Массовая подготовка моноклональных антител

Внешняя культура.

(1) Внутренняя индукция для получения мышей Balb / c, первая инъекция брюшной полости 0. 5 мл жидкого парафина или дегенерата для предварительной обработки. Через 1 - 2 недели внутрибрюшной полости вводят гибридные опухолевые клетки. Клетки гибридной опухоли размножаются в брюшной полости мыши и производят и выделяют моноклональные антитела. Приблизительно в течение 1 - 2 недель наблюдалось расширение живота у мышей. При заборе асцита с помощью шприца можно получить большое количество моноклональных антител.

(2) Метод экстракорпоральной культуры культивирует гибридные опухолевые клетки в бутылках для культивирования. В процессе культивирования гибридные опухолевые клетки вырабатывают и выделяют моноклональные антитела, собирают питательную очищающую жидкость, центробежно удаляют клетки и их фрагменты, чтобы получить необходимые моноклональные антитела. Однако количество антител, вырабатываемых этим методом, ограничено. В последние годы постоянно появляются различные новые технологии и устройства культивирования, что значительно увеличивает производство антител. После того, как гибридные опухолевые клетки сливаются, они должны пройти скрининг, прежде чем их можно будет использовать. Клетки гибридной опухоли делятся на две группы: во - первых, для отбора клеток гибридной опухоли; Во - вторых, в первичных гибридных опухолевых клетках были отобраны гибридные опухолевые клетки, способные генерировать специфические антитела, и методы и принципы этих двух скринингов были различными.

Экспериментальные услуги частично