Услуги по подготовке поликлонированных антител

Услуги по подготовке поликлонированных антител

Общий процесс подготовки к полирезистентности: * Подготовка к антигенам - + иммунитет кролика - → Тестирование на эффективность и окончательная активация - + сродство и очистка антител - + концентрация и сохранение антител.

Конкретные этапы эксперимента заключаются в следующем:

1 Готовность кролика

Выберите здоровых 6 - недельных размеров новозеландского белого кролика двух (около 2 кг), чтобы адаптировать их к новой жизненной среде, по крайней мере, в течение нескольких дней, прежде чем взять кровь, предварительно взять кровь (для отрицательной ссылки)

1.1 аккуратно поместить кролика в неподвижную раму, чтобы он успокоился;

1.2 Осторожно сбрейте волосы на ушах кролика, чтобы кровеносные сосуды были видны (и не брить);

1.3 При необходимости можно наносить мелкие хлопковые шарики спиртом на участки кровеносных сосудов для расширения кровеносных сосудов;

1.4 забор около 10 мл крови (около 5 мл сыворотки) из ушной вены с помощью шприца;

1.5 Осторожно вынимайте иглу, правильно нажимайте рану, чтобы избежать кровотечения, а затем дезинфицируйте рану спиртовыми хлопковыми шариками;

1.6 Поместите собранную кровь в 37 C инактивировать на 30 мин, а затем в 4 'C на ночь, чтобы свернуть и выпустить сыворотку;

1.7 Хорошо свернутая кровь в 10 000 р / мин центрифуга 10 мин; h Сбор верхней очистки, то есть сыворотки.

Иммунитет кролика.

2.1 Для введения двух кроликов антиген составляет 1 мл, антигенный буферный раствор не должен содержать вредных для кроликов химических реагентов. Первоначальная иммунизация каждого кролика 400мкг антигена более подходит или может быть уменьшена соответствующим образом, чтобы получить лучшие результаты, последующая иммунизация достаточно 100 мкг за раз.

2.2 Полностью перемешать 1 - метровую добавку флория * с подготовленным 1 - метровым антигеном в молочно - белом цвете; А.

2.3 Осторожно вынимайте кролика из клетки, вязаный кролик иммунизирует 4 части (как спина, так и корни бедра), каждая часть 250ul, игла вставляется под кожу под углом 45 градусов 1 - 2cm, после инъекции остается на несколько секунд, чтобы предотвратить отток антигена.

2.4 Цикл болезни кролика составляет 20 дней, а взятие крови (включая взятие крови на промежуточном тесте и окончательный кровопускание) происходит через 7 - 10 дней после иммунизации, и в общей сложности иммунизация проводится 4 - 5 раз.

3. Проверка эффективности

3.1 2 эталонных отрицательных ссылок на предварительно взятую сыворотку крови, все разбавлены 1 антиначальной концентрацией (закрытый разбавленный раствор); Положительная ссылка на предыдущие

Положительная сыворотка

3.2 Добавление 100ul на пористую каплю в пластине 96 отверстий, 1 ug / m антигена, на ночь в 49C, также может вылупиться при 37°C в течение 2 часов.

3.3 Налейте антигенный раствор и добавьте закрытую жидкость 200u на отверстие, 49C на ночь или 379C на инкубацию в течение 2 часов.

3.4 Налейте закрытую жидкость, хлопайте на всасывающей бумаге, чтобы высушить остаточную жидкость, используйте промывочную пластину для промывки жидкости три раза, чтобы попытаться высушить остаточную жидкость, если вы хотите поместить ее в течение некоторого времени, 37°C сушить и запечатать в закрытом кармане до 20°C для хранения.

3.5 Возьмите пакет с хорошей 96 - дырочной пластиной,第---В отверстие добавляется отрицательная референтная жидкость 100ul, во второе отверстие добавляется положительная референсная жидкость 100ul, в третье отверстие добавляется 1: 500, ожидающая тестирования антисыворотка, последующие отверстия на этой основе удваиваются по сравнению с разбавлением, инкубация при 37°C в течение 1 часа.

3.6 Слить жидкость, три раза промыть доску моющей жидкостью и высушить. Каждое отверстие добавляет 100u HRP маркеров мыши против кроличьего LGG (разбавлено 1: 2000), вылупляются при 37°C в течение 45 минут.

3.7 Слить жидкость, три раза промыть пластину моющим раствором и высушить. Каждое отверстие добавляется к 100u TMB - субстрату (Sigma Sigma Simple TMB) при 37°C инкубации в течение 5 - 20 минут (время проявления цвета определяется в зависимости от глубины цвета).

3.8 В каждое отверстие добавляется концевая жидкость 50u (2N H2SO4) для считывания значения поглощения на длине волны 450 нм на энзимометре.

После того, как тест на антитела достигнет более 1 миллиона, кролик может получить окончательный кровоток.

Очищение антителами

4. сродство антител - подготовка сродственных колонн

4.1 Утверждается, что 1 мг геля агара CNBr - Sepherose 4B добавляется в соляную кислоту 2mmol / L, а 4 'C делает его полностью растворимым в течение ночи, получая 3 - метровый растворитель.

4.2 Гель переносится в очищенную колонну и 3 раза промывается соляной кислотой около 20 мл 2 ммоль / л.

4.3 Промыть диэлектрик сцепленным буфером - раз, так как активированная группа легко гидролизуется при pH сцепленного буфераСделай это за несколько минут.

4.4 Добавление 5 - 10 мг антигена, растворенного в 5 мл сцепленного буфера, в гель

4.5 Небольшое смешивание колебаний при комнатной температуре в течение 2 - 4 часов или 4 'C на ночь, если необходимо измерить эффективность связывания после этого шага взять небольшое количество раствора для измерения. Промыть диэлектрик 20 мл сцепного буфера один раз.

4.6 Добавление 15 м1 1% раствора BSA для инкубации при комнатной температуре в течение 2 часов или 4 'C на ночь.

4.7 Промывание среды фосфатным буфером более 3 раз, более 15 м каждый.

4.8 Антигенное твердофазирование завершено и может использоваться для очистки.

4.9 Если не используется немедленно или после использования, запечатывайте 20% этанолом.

5. Очищение и сохранение антисывороток

5.1 Антисыворотка разбавляется PBS и другими объемами, 5 000 - 10 000 / мин центрифуги в течение 15 минут, снимая очистку.

5.2 Промыть антигенные сродственные колонны 10 - кратным объемом PBS, чтобы сбалансировать колонны.

5.3 Разбавленная антисыворотка 10 м добавляется в хорошо сбалансированный столб.

5.4 Небольшое смешанное раскачивание при комнатной температуре 2 - 4 часа, или 4 'C на ночь

5.5 Очистить антигенные колонны 10 - кратным объемом PBS, чтобы смыть смешанные белки, связанные с колоннами

5.6 Промыть колонну в два раза большим объемом раствора для снятия антител, чтобы получить специфические антитела

5.7 Равновесие колонн с 10 - кратным объемом PBS

5.8 Закройте колонну 20% спиртом, сохраните 4 'C.

После получения очищенного антитела, после концентрирования тростникового сахара или полиэтиленгликоля, диализ в PBS для удаления соли, ультрафиолетовый видимый спектрофотометр на длине волны 280 нм для определения значения OD антитела, полученное значение OD, деленное на 1,35, представляет собой измеренную концентрацию антитела, добавление 40 - 50% глицерина помещено в 20 ^ C может быть сохранено в течение длительного времени.

Экспериментальные услуги частично